做过高通量测序的小伙伴都会遇到荧光定量PCR验证工作,初次接触的话,挑选内参基因有时是个让人头疼的事,今天小编就和大家聊一聊内参基因选择的那些事!假如您有QPCR验证实验需求,可以联系我们,我们会为您提供专业快捷质优价廉的实验服务!详询微信llcheng1314。
内参基因一般都挑选管家基因,管家基因(持家基因)是一类高度保守、甲基化水平低并且持续处于活性转录状态的基因,其表达水平不易受环境因素影响,一般是维持细胞最低限度功能所需的基因,如组蛋白编码基因、核糖体蛋白编码基因、线粒体蛋白基因等。
(1)无组织特异性,各组织中表达无明显差异;
(2)表达水平与细胞周期、活化无关;(3)表达不受外源或内源因素影响;(4)表达量不要太高或太低,中等表达量为宜;(5)不存在假基因;
1. 检测mRNA(LncRNA)和蛋白的表达
QPCR检测mRNA表达差异或做Western blot应该是最常见的,内参通常选择:Bata-actin、GAPDH、18S rRNA。
(1)GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写,经典的糖酵解反应中的一个酶。该酶广泛存在于众多生物体中,并且在细胞中含量丰富,占总蛋白的10%-20%;GAPDH基因序列高度保守,在同种细胞或者组织中的表达相对恒定,故常被用作qPCR或Western blot的内参基因。
(2)Bata-actin即β肌动蛋白,是细胞骨架微丝、肌肉细丝的主要成分,在维持细胞结构、细胞内运动、细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用,该基因几乎在所有真核细胞中表达,广泛存在哺乳动物动物的组织与细胞内。
(3)18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列,其编码基因rDNA(18S rRNA/rDNA)在生物演化过程中相当保守,存在于所有真核生物细胞中高峰度表达; 并且rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成,mRNA是由RNA聚合酶II合成,因此rRNA合成的调节独立于mRNA,在影响mRNA表达的各种条件下,各种rRNA水平很少发生变化。18S rRNA不适合选作内参的情况:rRNA转录易受到各种生物因素和药物的影响,在有丝分裂期间,28S、18S rRNA明显减少或不表达;另外rRNA不含poly(A)尾,在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录,所以建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外,还要用18S作为反向引物,反转录后的cDNA最好用RNA酶处理一下,再高温灭活。
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