样本提取是实验关键一环,没有好的样本,一切数据就犹如没有地基的大厦,盖得越高,倾覆的概率就会越大!所以开展好一个实验,首先要从评价核酸质量是否达标开始,RIN值是样本检测中比较重要的指标,今天就给大家聊聊RIN值!
RIN值,即RNA integrity number(RNA完整值),是安捷伦公司开发的以数字化形式表示 RNA 完整性的参数。在高通量测序样本检测报告中经常出现,用来衡量样品中抽提的RNA的质量;了解RIN值需先了解下28S和18S比值。
28S和18S比值:28s和18s是真核生物RNA(核糖体RNA)的两个主要亚基,在完整性较好的RNA样本电泳条带上应是28S在上,18S在下,且亮度为28S是18S的两倍,理论上未发生降解的RNA样本28S/18S比值等于2.0;但在实际取样提取过程中,RNA可能会发生各种途径的降解,体现在电泳条带上就是28S/18S比值会下降;此前,研究者们已将核糖体比值作为特征值应用在生物分析仪软件中,用来表征凝胶分析中RNA 的完整性。然而,仅通过总RNA的核糖体比值去评估RNA的完整性通常不准确,而Agilent 2100生物分析仪系统通过显示RNA片段大小分布的详细画面(下图),能更好的评估RNA完整性。
注:总RNA样品经过不同时间降解,并且在Agilent 2100生物分析仪系统上使用真核细胞总RNA Nano分析法分析所得的样品;随着降解推进,可以观察到向较短片段大小方向偏移。RNA降解是一个逐渐的过程,随着降解推进,18S/28S核糖体条带比减小,而两个核糖体峰和下位内标之间的基线信号增大(图1)。RNA完整值(RIN)这一指标,就是基于整体电泳图,将真核生物总RNA质量分类,并设定RIN数值范围为1-10,其中1代表降解最严重的情况,10代表最完整。通过这种方式,有助于解释电泳图,令样品之间的比较成为可能,并确保实验的重复性。更多详细信息参见安捷伦公司的应用简报,链接:https://wenku.baidu.com/view/90ab7b29370cba1aa8114431b90d6c85ed3a8887.html。
动物样品胶图上可见目的条带为28S、18S、5S,植物样品为25S、18S、5S,昆虫、软体动物等是18S、5S,原核生物是23S、16S、5S。
所以不同物种的Agilent 2100 数据显示还是有一点点差别的,差别主要是25S、23S等的区别。
理想的电泳图可以展示以下要素信息:前区、5S区、快速区、中区、前体区、后区以及3个高耸的标准品峰、18S峰、28S峰。
不同降解程度2100图如下,可以看到样品降解会在快速区、5S区出现波浪状杂峰,基线上抬等现象:
目前安捷伦2100出的结果图如下:比较重要的指标小编已经在图中注释了,看起来应该比较直观。
高通量测序对样品要求很高,但并不是要求样品不能有一点降解,一般轻微降解是符合上机要求的,比如在转录组测序中,样品RIN值具体标准如下:动物:RIN≧6.3;植物、真菌:RIN≧5.8,基线平整(软体等无28s物种);当然,样品合格与否不仅取决于RIN值,还要结合其他指标综合判断。好了,今天RIN值就先介绍到这里,祝您在新的一周里收获多多!
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