上一期给大家介绍了转录组建库原理：转录组扫盲系列--转录组如何建库？建完库下一步就是测序，测序原理讲起来其实很复杂，但是我觉得测序过程少了解一点对于理解转录组数据影响不是很大，下面有个视频，大家可以了解一下小小的测序芯片方寸之地的波澜壮阔的工程之美：illumina测序原理-组学生物翻译（点此链接观看）。

数据下机后就是数据分析，在整个分析流程中我觉得最重要的步骤就是reads比对参考基因组，了解比对过程对于了解转录组的大有裨益！今天我就给大家介绍下reads是如何比对到参考基因组的。

什么是插入片段？reads？

前面建库原理部分我们讲过受制于测序技术的原因，基因需要先随机打断成300bp左右的小片段然后再反转录，这些反转录好的300bp左右的cDNA称为插入片段（Insert Fragment），如下图：两端深蓝色部分是测序接头（adapter），中间淡蓝色是要测序的插入片段，插入片段长度（Insert size）指的就是这个浅蓝色部分的长度。

目前的高通量测序仪是双端测序，也就是分别从插入片段两端进行测序，每一端读取的ATCG序列称为一条reads，每条插入片段都会产生2条reads，即reads1和reads2，一个样品对应的reads1和reads2数据是分为2个压缩包存放的，我们也把这些未过滤的reads称为原始数据（raw data），过滤掉接头及低质量的reads后的数据称为clean data。

有参转录组reads比对参考基因组

参考基因组是指该物种已经破译的全基因组序列信息及注释文件，reads比对到参考基因组是数据分析的第一步，也是最重要的一步，其他所有分析内容都是基于reads比对结果分析的，如下图：

3. 剪接比对

经上述2步未被映射上的read将会被片段化，通常默认大小为25bp，再次比对到基因组上，该步骤较为复杂，可总结为以下3个步骤，如下图，（a）寻找剪接位点：如果TopHat2发现reads片段化后的左右两个片段位于用户定义的最大内含子区长度范围内，TopHat2就会将read映射到整个基因组的区域以便于去寻找那些含有剪接信号(GT-AG, GC-AG, or AT-AC))的剪接位点；（b）串联间隔序列：将步骤（a）中找到的潜在的剪接位点的侧翼基因组序列被串联起来，并构建索引，未映射的read片段用Bowtie2比再次比对串联的侧翼序列。（c）重新比对：被分割的片段重新连接形成完整的reads成整个reads的跨内含子比对。

需要注意的是在步骤2 reads比对到基因组中会有一些reads会比对到内含子区域，此类reads将会用新的剪接位点的信息进行重新再比对一次。

无参转录组reads比对

无参物种没有可用的参考基因组，是如何进行reads比对的呢，如下图：我们可以看到与有参不同的是无参转录组需要先将reads拼接、组装成转录本，目前常用的组装软件是Trinity，该软件是由耶路撒冷希伯来大学和Broad研究所共同开发的一种针对无参考基因组RNA-Seq数据构建转录本的工具。

对于某个基因Trinity可能会拼接出多个对应的转录本，一般会选取其中长度最长的转录本作为Unigene来代表该基因的转录本，把所有的unigene组成的序列集当做该物种的参考基因组，然后就可以进行reads比对了。

reads比对中的几个关键概念

Mapped reads：比对到参考基因组（无参物种是unigenes，下同）的reads，mapped reads并非严格要求100%比对，比对软件一般都会有一定的容错率，一般reads与参考基因组允许最大错配为2个碱基。

Multiple mapped reads：比对到参考基因组多处位置的Reads数目。

Uniq Mapped reads：比对到参考基因组唯一位置的reads。

mapping rate：比对到基因组的reads占clean reads的比值；比对率会随着亲缘关系、基因组组装质量、测序质量、有无污染等有所波动，一般mapping rate大于60%，再低的话就要考虑进行无参组装了。

BAM文件：reads比对到参考基因组后，会得到一个以sam或bam为扩展名的文件，而bam就是sam的二进制文件，也就是压缩格式的sam文件，里面存储了reads的比对信息，更多信息请参见：你了解SAM和BAM文件吗。

好了，reads比对今天就介绍到这里，希望对您的学习有所帮助！下一期我会继续给大家分享如何利用reads计算基因的表达量，感兴趣的朋友请持续关注！

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