单细胞测序，通俗地来说，就是在单个细胞水平上对基因组、转录组、蛋白质组进行测序分析的技术。传统的转录组测序是对多细胞组织进行的混合测序分析，得到的是一群细胞内的基因表达的均值，由于单个细胞之间存在异质性,这样的数据丢失了细胞与细胞之间的差异信息。而单细胞技术能够检测到混合样品内单个细胞的表达谱，弥补了传统测序技术的缺陷。

注：单细胞测序技术示意图

目前的单细胞测序方法

目前常见的单细胞测序方法主要有:Smart-seq2、CEL-seq2、sci-RNA-seq、10x Chromium、Drop-seq、Seq-Well、inDrops其中Smart-seq2、CEL-seq2是基于微孔板的方法进行测序，属于低通量测序；sci-RNA-seq是基于微孔板组合的方法来隔离细胞并标识细胞，属于高通量的分析方法；10x Chromium、Drop-seq、inDrops是基于微流控产生的油包水的方法来隔离细胞，并且是用带barcode序列的引物微珠来标识细胞的，是高通量的方法；Seq-Well采用微孔芯片来隔离细胞，再用微珠来标识细胞，属于高通量方法。

10x Chromium原理

目前应用最多的商业化单细胞测序技术为10x Genomics公司的推出10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution。并且经过多年的产品更新，目前10x Genomics Chromium™系统不仅可应用于单细胞转录组方向，还可以进行单细胞免疫谱分析、单细胞ATAC-seq、单细胞CNV分析、Linked-read基因组重测序、基因组denovo分析以及空间转录组分析等。下面详细介绍10X公司单细胞测序原理。

10X Genomics技术流程注：10x Chromium测序流程示意图1. 凝胶微珠：珠每个Chromium解决方案都从高度多样化的凝胶珠（Gel Beads）。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成，引物序列构成依次为：全长Illumina TruSeq Read 1 测序引物、16nt 10X Barcode序列（每个Gel bead的10X Barcode均不相同，用于区分细胞）、12 nt unique molecular identifier (UMI) （区分同一细胞的不同转录本并去除PCR Duplications，实现绝对定量）、30 nt poly dT反转录引物，用于捕获mRNA。

2  单细胞乳浊液制备：基于微流控技术进行单个细胞分选，从横向管道输入凝胶柱（包含barcode和引物），第一纵向管道逐个输入细胞，凝胶柱碰撞到细胞时将细胞吸附，将其输入到第二纵向管道，即油相管道，油滴包裹凝胶珠以及细胞，被收集起来。将带有条形码标签的凝胶珠与细胞或细胞核、酶以及液油混合，产生成千上万个单细胞乳液微滴，这些微滴被称为“GEM”（Gel Bead-in-emulsion）。

3 测序文库构建：每个GEM都作为单独的反应微滴，凝胶珠在其中溶解，捕获 每个细胞的目标分子，添加barcode并扩增。来自同一细胞或细胞核的所有片段都共享一 种10x barcode。将成千上万个细胞的带有barcode的产物混合， 进行下游反应，从而产生与短读长测序仪兼容的文库。 

完整文库的序列结构如上图，左边由左到右：P5接头、P5测序引物（黑色Read1）、16bp 10x™Barcode、10bp UMI、poly dT、插入cDNA片段；右边：P7测序引物（黑色Read2）、样本Index、P7接头。一般情况下测序将使用双端PE150测序。测序的Read1包含了16bp Barcode（单细胞标记） 和10bp UMI的序列信息，用于后续的单细胞分析。测序的Read2为3‘断的一部分序列。

10x 单细胞转录组测序优缺点

10x Genomics单细胞转录组测序优点1、简单便捷：集单细胞分选、扩增、建库于一体；2、细胞通量高：每个样本细胞数可达500-10000个；3、建库周期短：1天可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库；4、超高捕获效率：单细胞捕获效率高达65%；5、真正意义的单细胞：单个液滴捕获到多个细胞的概率极低（0.9%/1000cells）；

10x Genomics单细胞转录组测序缺点

1、非全长信息：只能获得3’端转录本信息；

2、样本要求高：单个样本细胞起始量达10^5-10^6个，活细胞数目需超过80%，建议在90%以上最佳。

参考文献：
Ding J, Adiconis X, Simmons SK, Kowalczyk MS, Hession CC, Marjanovic ND, Hughes TK, Wadsworth MH, Burks T, Nguyen LT, Kwon JYH, Barak B, Ge W, Kedaigle AJ, Carroll S, Li S, Hacohen N, Rozenblatt-Rosen O, Shalek AK, Villani AC, Regev A, Levin JZ. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):737-746. doi: 10.1038/s41587-020-0465-8. Epub 2020 Apr 6. Erratum in: Nat Biotechnol. 2020 Apr 27;: PMID: 32341560; PMCID: PMC7289686.
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