遥想当年，测一个转录组要一万多，现在只要一千多，旧时只有大课题组才能负担的堂前燕现在也飞入了寻常实验室。同时伴随着测序价格的下降，不少老师也在感叹简单测几个转录组就能发SCI的好时期过去了，可事实真是这样吗？

今天要分享的这篇文章中作为实验主体的转录组实验只测了5个样品，刊在了2017年9月的Scientific Reports上，大家先一起来看看吧。

研究背景及目的：

丹参（Salvia miltiorrhiza）是中国传统的药用植物，其生物活性成分主要可以分为两类：水溶性的酚酸、二萜类丹参酮。已有研究证明茉莉酸甲酯（MeJA）可以同时提高酚酸和丹参酮的产量，而酵母分泌物（YE）只能诱导丹参酮的积累。作者通过使用这两种诱导剂对丹参毛状根进行处理，观察处理前后组织在化合物含量及基因表达层面的变化，以期研究两类活性物质生物合成的分子机制。

实验设计：分别用MeJA和YE处理丹参的毛状根，并在处理后1h、6h、12h取样。

1. 化合物检测：使用HPLC对未经处理的毛状根（control）以及用两种诱导剂处理之后1h、6h、12h的毛状根进行酚酸类物质（包含Sal A, Sal B , CA）和丹参酮类物质（包含DT, CT, T1, T2A）含量的测定；

2. 转录组测序：对未经处理的毛状根（control），MeJA处理后1h、6h，YE处理后1h、12h，总计5个样品进行RNA-seq（每个样品由3个丹参个体混合而成）。

化合物检测结果

化合物含量检测结果：MeJA处理组，丹参的总酚酸含量最高增多了0.56倍，总丹参酮含量最高增多了1.94倍；YE处理组，丹参的总丹参酮含量最高增多了4.47倍。诱导作用还是很显著的。

图注：图A为MeJA诱导之后毛状根的丹参酮类物质含量测定结果；图B为YE诱导之后毛状根的丹参酮类物质含量测定结果；图C为MeJA诱导之后毛状根的酚酸类物质含量测定结果；图D为YE诱导之后毛状根的酚酸类物质含量测定结果

转录组数据概述及标准分析

测序数据概述：5个样品下机数据经过滤之后分别得到了27M~41M不等的reads（Hiseq 2000，PE100），换算成碱基数量，相当于5.4G~8.2G的clean data。利用Trinity软件组装得到了55588条unigenes，N50为1772bp，其中42458条得到了注释信息。

差异基因注释统计： MeJA处理组相对于对照组检测到5767个上调基因（筛选标准FC>2，FDR<0.01，下同），YE处理组相对于对照组检测到5767个上调基因4482。对差异基因进行GO富集之后，作者统计了不同比对组差异基因中富集程度最高的5个功能类。经统计发现MeJA处理组在次级代谢产物合成、苯丙烷合成、代谢通路、通过植物激素信号转导的倍半萜和三萜类生物合成等相关的差异基因要明显多于YE处理组。相对的，YE处理组在植物病原菌互作、萜类化合物相关的差异基因要远多于MeJA处理组。

先寻找已知相关基因的表达情况

酚酸及丹参酮合成相关基因分析：

根据已发表文献提供的酚酸和丹参酮生物合成相关基因信息，在此次转录组数据中鉴定到丹参酮相关的66个基因能够编码26种酶，同时鉴定到酚酸合成相关的37个基因能够编码17种酶。

具体到YE处理组，有50个丹参酮合成相关基因发生了差异表达，这要多于MeJA处理组中的33个。但是MeJA处理组有6个和酚酸合成相关基因产生了差异表达，而在YE处理组里并没有发现这种情况。可以推测YE比MeJA对丹参酮合成发挥了更大的作用，但是只有MeJA对酚酸的合成产生明显的作用，这和HPLC的检测结果相一致。此外作者对丹参酮合成相关的12个基因、酚酸合成相关的7个基因进行了qRT-PCR验证，结果相当一致。

响应诱导剂处理的P450s基因：
细胞色素P450s是植物中几个最大的超级基因家族之一，参与了很多代谢活动。作者通过基因共表达分析的方法，在MeJA处理组从上调的P450基因家族中找到了45个与CPS1, KSL1, CYP76AH1（这三个是已报道的与丹参酮积累相关的基因）存在共表达关系的基因，在YE处理组找到了27个基因。然后将这45+27个基因连同其他植物的P450s基因进行了NJ进化树分析，进而对这45+27个基因进行了分类。图注：P450基因家族与已知参与活性物质合成相关基因的共表达分析结果

 接着用同样的方法从上调的P450s基因家族中找到了26个与TAT1, HPPR1 ， RAS1（确认参与酚酸代谢通路的基因）有类似表达模式的基因。2个已经被报道在酚酸和丹参酮合成过程中有关键作用的基因（P98A14和CYP76AH1），在MeJA处理组检测到了上调表达，进一步确定了这2个基因的作用。

还得看看参与下游代谢反应的基因

参与丹参酮和酚酸生物合成的下游候选基因的鉴定：

根据已有报道，脱羧基酶、脱氢酶、还原酶在丹参酮合成的下游反应中起作用。于是作者在转录组数据中寻找与姜的短链脱氢酶ZSD1、青蒿的aldehyde Δ11(13)还原酶DBR2有较高同源性的序列，最终找到13条与这两个基因有42%以上同源性的序列，经过统计，这13个基因在两个处理组中均有显著的高表达，预示着脱氢酶和还原酶在丹参酮的合成过程中起到了作用。

根据已有报道，漆酶可能是催化迷迭香酸生成丹酚酸A的催化酶，作者将毛竹的两个漆酶相关基因Lap1A和Lap2的序列在转录组数据里进行检索，找到了7个类似的基因。

再加上转录因子的分析就圆满了

响应诱导剂处理的转录因子：

作者鉴定并筛选出了375个在处理前后有差异上调表达的转录因子，这比已报道的数量要多，但是包含WRKY, bHLH, AP2-EREBP和NAC在内的四类主要转录因子都表现出了上调的表达模式，这和前人的研究是一致的。

 已有研究报道WRKY,AP2-EREBP, MYB, GRAS和bHLH在植物次级代谢调控中有重要作用，作者鉴定了两个处理组间独有及共有的并属于上述4个家族的转录因子。作者描述了这四个转录因子家族已知的作用，并结合它们在两个处理组中不同的表达情况，来推测这些转录因子在丹参酮和酚酸合成中起到的作用。

这样看来是不是您也可以呢？

文章到这里就说完了，这篇文章在实验方面做了5个转录组、几十个qRT-PCR、测定了7种化合物，都是很成熟的实验技术，大家可以很方便的委托公司或者自行完成。但是作者在分析方面花的心思可不少，从几千个差异基因中找到几十个与目标相关的基因，共表达分析有协同作用的P450s基因，鉴定活性物质合成上游的转录因子、参与下游反应的候选基因，每一步都大量借鉴了前人已有的研究基础，并引用自己的数据对已有结果进行验证、拓展和升华。已报道的文献为分析提供了引导方向，作者自身对数据的理解让分析走的更深远，所以说想少花钱多办事，不仅得站在巨人的肩膀上，还得修炼好自身啊！

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参考文献：Zhou W, Huang Q, Wu X, et al. Comprehensive transcriptomeprofiling of Salvia miltiorrhiza fordiscovery of genes associated with the biosynthesis of tanshinones and phenolicacids[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1):10554.