Flye是用于单分子组装数据的denovo基因组装的软件。这个软件可以用于各种数据集，从小的细菌到大的哺乳动物。

输入是原始的PacBio或者ONT的序列文件，输出是polished的contig。Flye同时也有针对微生物组装的模式。

一、安装

1.conda安装

conda install flye

2.编译安装

#官网下载
wget https://github.com/fenderglass/Flye/archive/refs/heads/flye.zip
#解压文件
unzip flye.zip
#安装软件
cd Flye-flye
make
#将软件添加到环境变量（根据自己的安装路径进行添加）
vim ~/.bashrc
PATH=/opt/biosoft/GENOME/Flye-flye/bin/：$PATH
source ~/.bashrc

二、使用

Flye常用选项参数：

--pacbio-raw：设置 pacbio 原始数据所在路径
--pacbio-corr：设置纠错后 pacbio 数据所在路径
--nano-raw：设置 nanopore 原始数据所在路径
--nano-corr：设置纠错后的 nanopore 数据所在路径genome-size：预估基因组大小，评估覆盖深度
--out-dir：输出结果文件路径
--threads：线程数
--min-overlap：最小 overlap 连接大小

使用的话，输入文件是FASTA或者FASTQ格式的，可以是gz压缩或者普通文本。对于raw的话，期望的错误率低于30%，校正之后序列的错误率低于3%，HiFi序列的低于1%。不过要记住，Flye最开始是基于raw reads开发的。

已经不需要提供基因组的大小，但是如果使用 --asm-coverage 则需要提供。

为了减少内存的消耗，可以使用最长的reads来进行初始化的disjointig的组装，使用--asm-coverage和--genome-size就可以了。一般而言，40x的深度已经足够了。

可以单独使用--polish-target进行结果打磨。

常用命令

#针对pacbio数据
flye --pacbio-raw E.coli_PacBio_40x.fasta --out-dir out_pacbio --threads 4
#针对ont数据
flye --nano-raw Loman_E.coli_MAP006-1_2D_50x.fasta --out-dir out_nano --threads 4

三、输入数据的类型

1. Oxford Nanopore：使用--nano-raw，ONT的数据错误率在5%-15%之间，尤其是在同聚物区域，错误率更高。
2. PacBio HiFi：使用--pacbio-hifi的参数来选择这个模式。期望错误率低于1%，我们也可以用--hifi-error这个参数来指定错误率，这样可以获得更完整的组装。
3. PacBio CLR：使用--pacbio-raw的参数，错误率在15%左右。注意的是，使用这个模式需要去除接头和分开多个passes。不过需要注意别拆分出了错误的序列。
4. error-corrected reads：可以使用--pacbio-corr 或者 --nono-corr这个参数，来支持校正后的序列，这个序列错误率应该小于3%。如果组装的结果比较碎，可能序列中的错误率比较高，这个时候可以考虑用raw reads。
5. 多个contig的一致性序列：使用--subassemblies来输入一系列的组装好的contig序列，这个可以用其他组装程序获得，期望的错误率小于1%。这样的话，用--iterations 0 可以来跳过polishing stage。
6. 由于Flye可以直接使用raw reads，因此不需要前期的纠错。Flye会检测嵌合序列和低质量的序列，因此这个也不需要去除。然后，需要去除的是污染的序列。

四、参数描述

最小overlap长度

这个参数默认是reads N90，一般不需要设置。如果要设置，可以设置到3-5k。建议设置的越高越好，这样repeat graph就更少会纠缠，但是这样会产生更多的gap。

Metagenome mode

这个模式用于高度不均匀覆盖度的序列， 对于低至2x的覆盖度的区域也可以进行组装。在一些简单的metagenome中，使用普通的模式，会获得更多的长的序列，而用meta模式，序列会更加的片段化一些。对于复杂的metagenome，建议使用--meta模式。

Haplotype模式

默认的，Flye会合并graph中各种结构（bubbles、superbubbles、roundabout）等，来产生更长的一致性contig。使用--keep-haplotypes来保留更多的path，产生更细节的组装结果。

Trestle

Trestle是一个额外的模块，用于解析没有被read桥接的重复度是2的简单重复。根据数据集，它可能解析一些额外的重复，这对小的(细菌基因组)是有帮助的。使用--trestle选项来启用该模块。在大型基因组上，改善通常是最小的，但计算可能会花费大量时间。

覆盖度的降低

对于大基因组，当深度过高的时候，需要较高的RAM。因此可以使用--asm-coverage来选择特定的深度，一般而言使用30x比较合适。

打磨的迭代次数

程序的最后会进行polish。默认的只进行一次polish，进行多次polish会矫正更多的错误，如果设置为0，那么就不会进行polish。

五、结果输出

00-assembly              #构建基因组草图
10-consensus             #基于基因组草图对数据进行纠错
20-repeat                #对重复序列进行处理
30-contigger             #构建contig
40-polishing             #对结果进行校准
assembly.fasta           #最终组装结果文件，用于下游分析
assembly_graph.gfa       #最终的repeat graph，不过edge序列会和contig的序列不一样，因为contig可能会包含额外的多个边。
assembly_info.txt        #contig的额外的信息 

每个contig就是图里一个唯一的边，同时这个唯一的contig也会进行两边延伸，来解决repeat区域。

因此，具有相同id的contig，会比相应的edge要长。这个同OLC算法的软件相似。

有时候，也会将contig基于repeat graph结构拼接成scaffolds。这些结果会输出成以scaffold_为前缀的文件。
尽管很难估计可靠的gap大小，一般默认是100个Ns。并且assembly_info.txt文件也会输出这些scaffold是怎么构建的信息。

assembly_info.txt示例如下：

每列信息如下：

contig/scaffold id长度

覆盖度

是否是圈

是否是重复

重复度

Alternative group图的路径

用？？来代表scaffold的gaps，用*代表一个终止node。

参考：https://www.jianshu.com/p/efbd1998db69

https://github.com/fenderglass/Flye/blob/flye/docs/USAGE.md

Kolmogorov, M., Yuan, J., Lin, Y. et al. Assembly of long, error-prone reads using repeat graphs. Nat Biotechnol 37, 540–546 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0072-8