蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。

 

1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。

 

2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。

 

3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。

 

一、大肠杆菌表达系统

 

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。目前最常用的大肠杆菌表达系统为BL21-PET表达系统，此系统目前已经商业化，并且普遍应用于各大实验室和生物技术公司。

 

对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。

 

优点：遗传背景清楚；繁殖快、成本低、抗污染能力强；表达量高、表达产物分离纯化相对简单、稳定性好；商品化的载体和菌株种类非常齐全、适用范围广等。

 

缺点：

 

① 没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；

 

② 没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；

 

③ 表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体，尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成快速太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性，使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。

 

④ 可能会产生一些致热源(内毒素)，并且大肠杆菌本身含有内毒素和有毒蛋白，可能混杂在终产物里。

 

二、酵母表达系统

 

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。

 

常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统和甲醇营养型酵母表达系统。甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属应用最多。

 

优点

 

1. 生长方面：酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖快速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时有效降低了生产成本。毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产。

 

2. 安全性方面：酿酒酵母被认为是安全无毒的，有着数十年的大规模发酵研究基础。

 

3. 分子生物学操作方面：酿酒酵母在重组DNA中的广泛研究也是基于其己被人们掌握的大量分子生物学及生理学信息。外源基因一般和表达载体一起整合到了酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象。

 

4. 蛋白表达方面：可以进行蛋白的糖基化，而且还能分泌重组蛋白。

 

5. 蛋白分泌方面：由于毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，因此纯化方便。

 

缺点

 

1. 克隆基因的表达量低，发酵时间长，不正确的蛋白糖基化及抗细胞分裂。

 

2. 培养上清多糖浓度高，不利于纯化。

 

三、昆虫表达系统

 

昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。

 

杆状病毒系统的主要优点包括：

 

1．组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配

 

2．蛋白翻译后的加工修饰

 

3．表达水平高，可达总蛋白量的50%

 

4．可容纳大分子的插入片段

 

5．能同时表达多个基因。

 

主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡。

 

四、哺乳动物表达系统

 

哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。

 

根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂;瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高蛋白产量。

 

哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH/3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。

 

优点

 

1. 蛋白活性：由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

 

2. 哺乳动物细胞表达外源蛋白的最大优点是正确的高级结构（如糖基化）。

 

3. 哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。

 

缺点

 

培养基成本极高，培养周期长，至少一个月以上，培养较困难，表达量较低。

 

构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低，且有时会导致病毒感染。

 

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