一.研究背景

黑麦属于禾本科小麦族黑麦属植物，是大麦、小麦的近缘物种，具有抗病(如抗白粉病和条锈病)、抗逆、产量高等优质的农艺性状和强大的环境适应能力，因此是一种十分重要的农业作物。此外，黑麦也是一种重要的作物遗传资源：黑麦和小麦属间杂交产生的小黑麦，兼具黑麦和小麦的优良特性，是畜牧业养殖的一种优质饲料。然而，由于黑麦具有自交不亲和性，并且拥有极为复杂的基因组，导致其基因组精细物理图谱的组装十分困难，为了解析黑麦优良性状的遗传和分子基础，促进黑麦遗传育种改良相关方面的研究，作者对栽培品种“威宁黑麦”多代自交后产生的稳定的纯合自交系材料进行了基因组测序和分析。

二.实验材料

基因组获取：威宁黑麦自交18代后获得的高度纯合自交系材料，并用荧光原位杂交法确认其基因组带有 7 对染色体。

威宁黑麦(图源自网络)

三.研究结果

1. 基因组组装与注释

该篇文章中，作者使用了多种组装策略，利用高通量二代测序、PacBio单分子测序、染色质三维构象捕获 (Hi-C)、单分子光学图谱（Bionano）和高密度遗传图谱等技术构建了一个高质量的威宁黑麦基因组精细物理图谱。构建的威宁黑麦基因组大小为7.74 Gb，scaffold N50达到了1.04 Gb，并将93.67%的序列挂载到了7条染色体上，下图是使用crocs工具绘制的7条染色体特征。

图1.黑麦基因组特征。 (a)染色体中心粒位置(b)每条染色体上的转座子密度(c)高可信度基因密度(d)Gypsy 反转座子的密度(e)Copia 反转座子的密度(f)每条染色体上GC含量的分布，以及(g)同源基因之间的联系。

2. 黑麦基因组组装质量评估

随后，作者使用了多种方法对基因组组装质量进行了评估。首先，作者将组装结果与两个冬季黑麦品种（Lo7和Lo225）构建的染色体连锁图谱相比，结果表明威宁黑麦和两个冬季黑麦的染色体之间具有较高的一致性。同时，将本文章的黑麦Illumina 测序结果回贴到组装的基因组中，有 99.77%的reads 可以映射到威宁黑麦基因组上。然后作者通过LTR组装指数(LAI) 对基因组组装进行了评估。LTR组装指数是用完整LTR在所有LTR中的占比来评估基因组组装连贯性的一个指数，因为LTR序列较难组装,因此被用来检测组装质量，结果显示威宁麦的LAI值达到了18.42。除上述结果，BUSCO保守性评估结果为96.74%。以上结果均说明本次研究构建了一个高质量的威宁黑麦基因组。

Supplementary Fig. 2.威宁黑麦基因组物理图谱与冬季黑麦品种Lo7和Lo225染色体遗传图谱相关性评估

Supplementary Table. 8. 使用高通量二代测序数据评估基因组组装

Extended Data Fig. 4 通过LTR组装指数(LAI)评估基因组组装

3. 转座子分析

然后，为了探究转座子对威宁麦基因组组成的影响，作者进行了威宁麦的转座子研究。威宁黑麦基因组中90.31%被注释为转座子（TE），TE的含量明显高于其他禾本科物种。其中长末端重复反转录转座子（LTR）占84.49%，是TE的主要组成部分。接着作者将威宁麦的LTR与乌拉尔图小麦、节节麦及大麦的LTR进行比较，从以下4张图中可以看到：首先，Gypsy家族成员，也就是条形图中绿色的部分，占据了威宁麦LTR一半以上的组成(图a)，并且有3个属于Gypsy的家族成员（Daniela, Sumaya, Sumana）在威宁黑麦中出现了独特的扩张(图b) 。此外，从c图中可以看到，威宁黑麦中LTR插入时间存在独特的双峰分布，这与d图中Gypsy家族的两次扩张事件是吻合的。以上结果说明，某些反转座子丰度的增加可能最终导致了黑麦基因组的扩增。

图2 黑麦转座子分析

4. 黑麦基因组进化和染色体共线性研究

随后作者利用在威宁黑麦中获取到的2,517条单拷贝直系同源基因，重建了禾本科物种系统演化历史，通过构建进化树和计算分岐时间发现，黑麦和二倍体小麦的分化发生于大麦和小麦分化后(图a)。且以水稻基因组为参考基因组，作者发现了许多黑麦基因组独有的染色体重排，图中可以看到黑麦的染色体来自于祖先染色体的一些易位事件(图b)。最后作者分析了威宁黑麦基因组与普通小麦3套亚基因组之间的共线性关系，如图c所示。

图3 黑麦基因组进化和染色体共线性分析

5. 基因重复及其对淀粉生物合成相关基因的影响

为了探究基因复制事件对黑麦基因组的影响，作者使用MCScanX软件分析了黑麦重复基因的组成。从a图和b图中可以看到，黑麦中的近端重复基因（PDGs）、串联重复基因（TDGs）和转坐重复基因(TrDGs)数量显著高于其他一些禾本科物种。随后作者对黑麦淀粉生物合成相关基因的基因复制情况进行了研究，发现其中的多个成员分别发生了不同类型的复制，如图c所示，而通过图d的聚类结果我们又可以看到，同一基因的多个拷贝之间通常在表达模式上存在差异(不同组织和发育阶段)。以上结果说明不同类型的基因复制可以丰富黑麦基因在重要生物过程中的遗传多样性。

图4 黑麦基因复制事件及其对淀粉生物合成基因的影响分析

6. 黑麦种子贮藏蛋白(SSP)基因位点的分离

黑麦在胚乳组织中积累了丰富的种子储存蛋白(SSP),该类蛋白对麦类作物食用和加工品质具有决定性的影响。作者对黑麦SSP基因座进行了解析，从图a可以看到，黑麦中存在4个SSP基因座（Sec1-4），每个基因座中都包含了多个活性基因成员。对黑麦、小麦、大麦、节节麦SSP基因座进行共线性分析，在威宁黑麦中未发现小麦低分子量麦谷蛋白亚基或大麦B组醇溶蛋白的同源序列（图5b），表明在黑麦进化过程中携带这些基因的染色体片段缺失。并且在威宁黑麦基因组中未发现α-醇溶蛋白基因，这说明小麦及其近缘种的α-醇溶蛋白（α-gliadin）基因可能产生于小麦和黑麦分化之后。

图5 黑麦SSP基因座分析

7. 转录因子(TF)及抗病基因的注释和分析

随后，作者使用iTAK对黑麦和其他禾本科植物的转录因子（TF）基因家族进行了预测，与其他禾本科物种相比，威宁黑麦有 28 个家族的成员数量较多，其中AP2/ERF 转录因子基因家族成员增幅较大(见附表21)。同时，进一步的研究发现：威宁黑麦的抗病相关基因（DRA）数量也多于乌拉尔图小麦、节节麦、大麦、二穗短柄草、水稻以及普通小麦(附表22)。而AP2/ERF 转录因子家族和DRA抗病相关基因在植物应对非生物逆境和生物逆境的反应过程中具有重要的作用。

Supplementary Table. 21.黑麦与其他禾本科物种转录因子注释结果比较

注：上表为部分内容截取

Supplementary Table. 22.禾本科多物种抗病相关基因（DRA）统计

8. 早抽穗性状相关基因表达特征的研究

在研究过程中，作者观察到长日照条件下，威宁黑麦比荆州黑麦提前抽穗10-12天，有可能与威宁黑麦茎尖分生组织发育更快有关(图a、b)。由于开花位点T基因（FT）在高等植物开花时间控制中具有关键作用，作者检测了FT基因在这两个品系中的表达。作者在长日照条件下注释了两个相对高表达水平的FT基因ScFT1和ScFT2。从图c、d中可以看到，在播种后第7天和第10天（DAS），威宁植株中ScFT1和ScFT2的表达水平显著高于荆州植株。此外，作者在前面的分析中发现，实际的ScFT蛋白的分子量可能大于预期的分子量大小，推测其存在磷酸化的现象，并通过实验验证了该推测。该研究更进一步的对两个保守的磷酸化位点, S76和T132进行突变，转化烟草发现这两个位点的去磷酸化会引起烟草植株的开花延迟，并促进烟草生长，也就是图e，f。上述结果说明，保守的S76和T132残基的改变影响了ScFT2控制植物开花的功能。随后作者研究了光周期Photoperiod（Ppd）基因的表达，作者在威宁和荆州黑麦中注释了一个光周期基因——ScPpd1。该基因在威宁黑麦播种2 天后达到表达高峰；而荆州黑麦在播种4天后才达到高峰（图h）。随后作者在威宁和荆州麦杂交产生的F2代中检测到与前期研究一致的三个主效抽穗期（Hd2R、Hd5R和Hd6R）(图i)。

图6 与威宁黑麦早抽穗性状相关的基因表达特征分析

9. 黑麦驯化过程中染色体区域和基因座的挖掘

最后，作者通过全基因组选择清除分析，利用在栽培黑麦和瓦维洛夫黑麦（S. vavilovii），也就是黑麦的野生种之间鉴定的123647个SNPs，对黑麦驯化相关染色体区域和基因座进行了挖掘。通过DRI、FST、XP-CLR分析识别到了共有的11个选择信号(图b)。随后通过与水稻和大麦进行比较，筛选了一些候选的选择清除位点，包括在水稻或大麦中已被注释过的多个与驯化或重要农艺性状相关的基因，也就是图a中标注的基因。其中的ID1基因座包含一对串联重复基因ScID1.1和SCLD1.2，如图d所示，与玉米和水稻具有很强的同源性，这两个基因在玉米和水稻中都被发现调控着从营养体向花发育的转换，以上结果解析了栽培黑麦驯化的基因组基本特征。

图7 与黑麦驯化相关的染色体区域和位点分析

四. 讨论与总结

综上所述，作者构建了一个高质量的威宁黑麦基因组物理图谱(基因组大小为7.74 Gb，scaffold N50 为1.04 Gb，重复序列占总基因组的90.31%)，解析了黑麦基因组的基本特征和重要农艺性状以及驯化的相关分子机制，上述研究成果为黑麦驯化、麦类基因组演化和比较基因组研究提供了重要资源，对于加速黑麦及相关谷类作物的遗传改良具有重要价值。

参考文献：

Li G , Wang L , Yang J ,et al.A high-quality genome assembly highlights rye genomic characteristics and agronomically important genes[J].Nature Genetics[2023-09-27].DOI:10.1038/s41588-021-00808-z.