可变剪接(Alternative splicing)：一个基因的外显子以不同的组合方式剪接形成不同的成熟RNA，从而被翻译成不同的蛋白质构体，因此，一个基因可能编码多种蛋白质。这个过程极大的增加了mRNA和蛋白质的多样性。可变剪切是一种后转录生物学过程，对细胞活动和疾病过程具有重要的且广泛的影响。到目前为止，也有很多软件可对其进行检测，今天我们就来了解一下这款常用可变剪切软件rMATS的最新版详情。

rMATS介绍

rMATS是检测可变剪切事件的常用软件之一，其可以从RNA测序数据中，检测出多种类型的可变剪切事件，并提供了定量和组间差异分析的功能，可对生物学重复的样本进行组间分析。rMATS可识别的可变剪切事件有5种：

Skipped exon (SE)：外显子跳跃

Alternative 5' splice site (A5SS)：5’端可变剪切

Alternative 3' splice site (A3SS)：3’端可变剪切

Mutually exclusive exons (MXE)：外显子互斥

Retained intron (RI)：内含子保留

定量

rMATS采用exon inclusion level 来定义样本中可变剪切事件的表达量，以外显子跳跃（Skipped Exon）为例，正常的转录本称之为Exon Inclusion Isofrom, 发生了外显子跳跃的转录本则称之为Exon Skipping Isofrom。

用 I 表示比对到Exon Inclusion Isofrom上的reads，S表示比对到Exon Skipping Isofrom上的reads， 则该外显子跳跃的可变剪切事件比例可以表示为：

exon inclusion level实际上是inclusion isofrom所占的比例，计算时，用长度校正了原始的reads数。其他类型的可变剪切事件也可以划分成上述两种isoform, 示意图如下:

可以看到，rmats在计算isofrom的长度时，提供了两种方式，二者的区别就在于是否考虑跳过的exon的长度。

软件安装

rMATS turbo是rMATS的C/Cython版本。主要的差别在于速度和存储资源上，rMATS turbo相较于rMATS速度要快100倍，存储使用要小1000倍，因此我们安装rMATS turbo。

安装依赖：Python (either 2.7 or 3.6),BLAS,LAPACK,GNU Scientific Library,GCC,gfortran,CMake等。保证以上依赖均存在的情况下就可以进行安装了。其实安装好conda，这些基础的包均已包括了。

conda create -n my_rmats_env
conda activate my_rmats_env
conda install rmats-turbo
rmats-turbo --version

软件使用

参数说明：

python rmats.py -h
usage: rmats.py [options]
optional arguments:
 -h, --help            show this help message and exit
 --version             show program's version number and exit
  --gtf GTF             An annotation of genes and transcripts in GTF format
 --b1 B1               A text file containing a comma separated list of the
                        BAM files for sample_1. (Only if using BAM)
 --b2 B2               A text file containing a comma separated list of the
                        BAM files for sample_2. (Only if using BAM)
  --s1 S1               A text file containing a comma separated list of the
                        FASTQ files for sample_1. If using paired reads the
                        format is ":" to separate pairs and "," to separate
                        replicates. (Only if using fastq)
  --s2 S2               A text file containing a comma separated list of the
                        FASTQ files for sample_2. If using paired reads the
                        format is ":" to separate pairs and "," to separate
                        replicates. (Only if using fastq)
  --od OD               The directory for final output
  --tmp TMP             The directory for intermediate output such as ".rmats"
                        files from the prep step
  -t {paired,single}    Type of read used in the analysis: either "paired" for
                        paired-end data or "single" for single-end data.
                        Default: paired
  --libType {fr-unstranded,fr-firststrand,fr-secondstrand}
                        Library type. Use fr-firststrand or fr-secondstrand
                        for strand-specific data. Default: fr-unstranded
  --readLength READLENGTH
                        The length of each read
  --variable-read-length
                        Allow reads with lengths that differ from --readLength
                        to be processed. --readLength will still be used to
                        determine IncFormLen and SkipFormLen
  --anchorLength ANCHORLENGTH
                        The anchor length. Default is 1
  --tophatAnchor TOPHATANCHOR
                        The "anchor length" or "overhang length" used in the
                        aligner. At least "anchor length" NT must be mapped to
                        each end of a given junction. The default is 6. (Only
                        if using fastq)
  --bi BINDEX           The directory name of the STAR binary indices (name of
                        the directory that contains the SA file). (Only if
                        using fastq)
  --nthread NTHREAD     The number of threads. The optimal number of threads
                        should be equal to the number of CPU cores. Default: 1
  --tstat TSTAT         The number of threads for the statistical model.
                        Default: 1
  --cstat CSTAT         The cutoff splicing difference. The cutoff used in the
                        null hypothesis test for differential splicing. The
                        default is 0.0001 for 0.01% difference. Valid: 0 <=
                        cutoff < 1. Does not apply to the paired stats model
  --task {prep,post,both,inte}
                        Specify which step(s) of rMATS to run. Default: both.
                        prep: preprocess BAMs and generate a .rmats file.
                        post: load .rmats file(s) into memory, detect and
                        count alternative splicing events, and calculate P
                        value (if not --statoff). both: prep + post. inte
                        (integrity): check that the BAM filenames recorded by
                        the prep task(s) match the BAM filenames for the
                        current command line
  --statoff             Skip the statistical analysis
  --paired-stats        Use the paired stats model
  --novelSS             Enable detection of novel splice sites (unannotated
                        splice sites). Default is no detection of novel splice
                        sites
  --mil MIL             Minimum Intron Length. Only impacts --novelSS
                        behavior. Default: 50
  --mel MEL             Maximum Exon Length. Only impacts --novelSS behavior.
                        Default: 500

运行：

##/path/to/b1.txt
/path/to/1_1.bam,/path/to/1_2.bam
##/path/to/b2.txt
/path/to/2_1.bam,/path/to/2_2.bam
###运行
python rmats.py --b1 /path/to/b1.txt --b2 /path/to/b2.txt --gtf Gallus_gallus.GRCg6a.101.gtf --od A_vs_B --tmp A_vs_B/tmp -t paired --variable-read-length --readLength 150 --cstat 0.0001  --libType fr-unstranded  --novelSS --nthread 4

--b1 为组别1的bam文件的路径，若有生物学重复则bam文件路径用逗号隔开；

--b2 为组别2的bam文件的路径，若有生物学重复则bam文件路径用逗号隔开；

--gtf 为已知的基因及转录本的gtf文件；

--od 即为输出路径；

-t 测序类型为单端或者双端 ;

--variable-read-length 能够允许不同长度的长度的reads进行分析；

--readLength 若长度不一致时，可使用该参数将reads截取到给定的数值；

--libType 文库类型，可选择是否为链特异性；

--tmp 暂存目录；

--nthread 线程数。

输出文件详情请查看：https://github.com/Xinglab/rmats-turbo/blob/v4.2.0/README.md