​“ 2024年6月Frontiers in immunology 杂志发表了一篇题为Integrated analysis of single-cell RNA-seq, bulk RNA-seq, Mendelian randomization, and eQTL reveals T cell-related nomogram model and subtype classification in rheumatoid arthritis 的转录组分析文章 ” 文章借助单细胞转录组数据、芯片转录组数据以及eQTL遗传变异数据来筛选类风湿性关节炎中潜在的致病T细胞标志基因。

类风湿关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，全球约有0.5%–1%的人口患有该病。RA的发病机制尚未阐明，仍缺乏有效的治疗方法。
T 细胞调节 RA 疾病的发展，被认为是治疗的关键靶点。因此，文章通过整合多个数据集来探索 RA 的机制。建立了 T 细胞相关的诊断模型，为 RA 免疫治疗提供新方法。

从基因表达综合（GEO）数据库中获取类风湿性关节炎的scRNA-seq和bulk-seq数据集。采用多种方法分析和表征类风湿性关节炎的T细胞异质性。利用孟德尔随机化（MR）和表达数量性状位点（eQTL）筛选类风湿性关节炎中潜在的致病T细胞标志基因。随后，通过比较九种机器学习方法对类风湿性关节炎的预测，选择最优机器学习方法识别T细胞相关诊断特征，构建列线图模型。采用共识聚类法将类风湿性关节炎患者分为不同的T细胞相关簇。最后，对T细胞相关诊断特征进行免疫细胞浸润和临床相关性分析。

一、数据准备

在文章分析中用到了eQTL数据，来源于IEU OpenGWAS数据库；

RA GWAS 数据，来源于FinnGen R10 数据库；

scRNA-seq(GSE159117)数据和bulk RNA-seq(GSE93272、GSE89408、GSE77298)数据，来源于NCBI的GEO数据库。

二、结果展示

01. 类风湿性关节炎细胞类型的鉴定

对RA GWAS 数据进行分析，RA数据集中包含10211个细胞，被分为18个簇。对数据进行注释，结果如下：（图A）cluster0、1、2、3、9、10、11、12为T细胞（图B），标记基因为CD3D和CD3E（图D），并且T细胞是在RA免疫微环境中最丰富的细胞（图C）。

02. RA微环境中细胞间相互作用分析

使用 cellchat 包分析了 RA 微环境中 T 细胞与其他免疫细胞之间的关系（图A、B）。

又已知 MIF 信号通路可调节免疫反应和炎症，在 RA 微环境中发挥重要作用，可能影响免疫调节和疾病进展。图C、D、E展示说明T细胞作为信号传递体，主要通过 MIF 信号通路及其相关的配体-受体对（MIF-CD74 + CXCR4 和 MIF-CD74 + CD44）与其他免疫细胞相互作用。

此外，MIF 诱导的配体 CD74 在这些免疫细胞群中高表达（图F），可能与 T 细胞的发育分化密切相关。

03. 细胞的轨迹

根据T细胞亚型的标记基因，文章将T细胞分为以下7类细胞亚型（图A），不同的T细胞亚型表达不同的标记基因（图B）。

文章通过拟时间轨迹分析将七种T细胞亚型分为三种分化状态。不同状态下T细胞亚型的数量不同。CD8_Naive和CD4_Naive细胞主要富集于T细胞发育早期，主要分化为第一细胞状态；CD8_EM、MAIT和CD8_TE细胞处于第二细胞状态；CD8_CM和CD4_TE细胞处于第三细胞状态（图C）。

同时将T细胞发育过程中的基因变化分为三类，分别与细胞质翻译、免疫应答和T细胞介导的细胞毒作用的正向调控相关（图E）。

图D显示MIF诱导的配体CD74的分布随着分化期的变化而逐渐增加，这表明在RA免疫微环境中，随着T细胞的发育，T细胞对其他免疫细胞的作用逐渐增强。

04. 识别与RA相关的风险基因

文章从eQTL数据集中识别出309 个与 RA 相关的遗传显著基因，其中，153 个基因表达增加与 RA 风险增加显著相关，而 156 个基因表达增加与 RA 风险降低显著相关（图A）。

05. T细胞相关诊断特征的筛选及列线图模型的构建

基于前面的分析，文章选择了 1639 个 T 细胞标记基因与 309 个与 RA 有因果关系的基因进行交集（图 B），总共获得了 26 个基因，用于构建九个机器学习模型（图C），其中XGB机器学习模型显示出最高的AUC。

我们从XGB结果中挑选前十个基因，看一下在 GSE93272 转录组数据集的健康个体和RA患者中这10个基因的表达（图D），根据表达结果其中8个基因被定义为 T 细胞相关的诊断特征。

之后为了评估 232 例患者罹患 RA 的风险，文章对 8 个 T 细胞相关诊断特征构建了列线图模型（图E），校准曲线显示列线图模型准确预测了 RA。

最后文章用另外两组bulk RNA-seq转录组数据验证了列线图模型，得到 GSE89408 和 GSE77298 的 AUC 分别为 0.958 和 0.875（图F），进一步证明我们的诊断模型在区分 RA 和健康个体方面是有效的。

06. T细胞模式识别和免疫细胞浸润分析

为了研究与 RA 中 T 细胞相关的不同模式，文章根据八种 T 细胞相关诊断特征对 RA 患者进行了聚类分析。将 RA 分为两个不同的 T 细胞簇（cluster 1 和cluster 2）（图A）

PCA 结果显示两种 T 细胞模式之间存在明显区别（图B）。结果显示，且cluster 2 的 T 细胞评分高于cluster 1（图 C）

之后做了差异表达分析（图D）、免疫浸润分析（图E）、8个T细胞相关诊断特征与免疫细胞之间的相关性热图（图F）、以及基因集变异分析GSVA分析（图G）。GSVA 结果显示，Cluster 2 主要与非小细胞肺癌、癌症通路和胰腺癌等癌症有关，而 Cluster 1 在核糖体、RNA 降解和基础转录因子等信号通路中富集

07. 临床相关性分析

文章做了临床相关性分析，以确定不同 T 细胞模式的 RA 患者之间是否存在年龄和性别差异，并评估 T 细胞相关诊断特征与患者年龄之间是否存在显著相关性。

结果表明，在8个诊断特性下两种不同 T 细胞模式之间的年龄分布没有显著差异，性别比例也没有显著差异。

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