“ 2024年9月BMC Plant Biology 杂志发表了一篇题为“Pan-genome analysis of GT64 gene family and expression response to Verticillium wilt in cotton”的泛基因家族文章。”

该文章对8种棉花中GT64基因进行全面鉴定和系统分析，并研究了基因对黄萎病的表达响应。

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家族成员鉴定

文章选取了CottonFGD数据库中8个棉花品种参考基因组，并从Pfam数据库下载GT64的隐马尔科夫模型PF09258。通过HMMER搜索及Pfam、SMART、CDD数据库二次确认，最终共鉴定出39个GT64基因，分布在8个棉花基因组中。

对39个GT64基因家族成员进行氨基酸长度、蛋白质分子量、等电点、染色体位置等理化性质进行计算。如下图：

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泛基因家族分析内容

02-1. 系统发育树构建

提取39个GT64的蛋白序列，利用MEGA软件和ML方法构建系统发育树，根据进化分支分为5个亚家族，Class1~Class5。

根据同一亚家族中的成员关系，文章得出四倍体陆地棉和四倍体海岛棉都起源于二倍体棉花。

02-2. 染色体定位

针对8种棉花分别绘制染色体定位图-对GT64基因在染色体上的物理位置进行可视化。如图所示为其中4种棉花。

文章发现某些，例如海岛棉G.barbadense(图D)和陆地棉G.hirsutum(图C)棉花上GT64基因的分布模式相似，都是在染色体A05、A12、D04、D05和D12上鉴定出GT64基因。

02-3. 针对陆地棉中6个GT64基因进行进化树构建、基因结构分析、保守基序分析

如图所示：图A是GT64基因构建的进化树，图B是位于蛋白序列上的保守基序位置，图C是蛋白序列上的GT64保守结构域位置，图D是基因启动子区域预测得到的顺式作用元件，图E是GT64基因结构。基因的结构信息来自于CottonFGD数据库。

02-4. 8种棉花基因组间共线性分析

通过Blast方法对8种棉花的全部蛋白序列进行比对，并利用MCScanX软件对结果进行筛选得到具有共线关系的同源基因对，如下图所示：图中彩色线为不同品种间的同源基因对。

02-5. 基因组内共线性分析

分别对8种棉花的基因组内进行共线性分析，在三个二倍体棉花品种中未发现同源基因对，在5个四倍体棉花品中个发现三对同源基因对。如下图A~图E结果展示：

02-6. 8个棉花品种的KA/KS选择压力分析

基于上面基因组间和基因组内得到的同源基因对进行选择压力分析，并将KA/KS值绘制到散点图中。如上图F~图H所示：

02-7. 陆地棉中GT64基因在不同组织、不同处理中的表达图谱

为了研究GT64家族的表达模式，以陆地棉不同组织、不同时间、不同处理等为样本，得到具体GT64基因的表达量结果并绘制热图。如下图A~图H。

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实验室功能验证分析内容

03-1. GhGT64_4基因增强烟草抗病性

基于前期分析，作者重点关注了陆地棉GhGT64_4基因，并通过实验将该基因转化到烟草中，观察烟草抗病性。

选取野生型烟草和过表达GhGT64_4野生型烟草分别接种vd592(致黄萎病)。之后观察表型，随着时间推移，过表达GhGT64_4植株的病情严重程度明显低于普通植株。表明GhGT64_4增强了烟草对Vd592的抗性。

并对烟草病害相关基因（NbPR1a、NbPR2、NbPR9、NbPR10a、NbLOX、NbERF1）进行 qRT-PCR 分析，发现，除NbERF1和NbPR9外，在过量表达GhGT64_4的烟草中，其余基因的表达水平普遍高于普通野生型烟草。如图E~图J所示：

03-2. GhGT64_4基因增强棉花抗病性

选取沉默GhGT64_4的棉花pTRV2:GhGT64_4植株和对照组pTRV2:00植株，随着时间推移，沉默GhGT64_4的植株抗性显著降低，病情指数更高（图E）。表明GhGT64_4与陆地棉对黄萎病的抗性有关。

利用qRT-PCR技术检测沉默植株中抗性相关基因的表达水平，结果如图F、G所示。在未接种vd592时，GhGT64_4正向调控PAL、4CL、PPO、PR1和AOC基因的表达（图F）。在接种vd592后，GhGT64_4正向调控POD、4CL、EDS1和ACO基因的表达（图G）。

PAL、4CL和AOC会影响木质素的合成，而木质素对保护棉花免受V. dahliae（黄萎病）感染。

03-3. G. hirsutum和G. barbadense之间的GhGT64_4转录分析

继续研究GT64在陆地棉和海岛棉抗黄萎病中的潜在机制。

文章选择TM-1（陆地棉易感品种）和Hai7124（海岛棉抗病品种）的90个样本表达量数据为基础，从中挑选GhGT64基因的表达量并绘制热图。如图热图A、B显示，GhGT64_2和GhGT64_4基因在两种样本中均高表达。

03-4. G.hirsutum和G.barbadense物种中的基因分别进行WGCNA分析

如图所示为陆地棉中的WGCNA分析结果：

图A为陆地棉的WGCNA基因聚类分析结果；

图B为颜色模块与性状之间相关性；

图C是GhGT64_4与其它基因之间的互作关系；

图D是与GhGT64_4有互作关系的前150个基因进行KEGG通路富集分析结果图。

03-5. 陆地棉和海岛棉中GhGT64的qRT-PCR分析

研究不同胁迫条件下不同棉花品种中GT64s的表达水平。

经过前期分析，重点关注了GhGT64_1、GhGT64_2、GhGT64_4、GhGT64_5这四个基因，可能在响应各种生物和非生物胁迫因素、绒毛纤维发育和调节棉籽含油量方面发挥作用。

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