在做遗传进化分析时，通常需要进行选择压力分析，筛选一下正选择基因。通常的做法是计算Ka/Ks，但是这种方法是比较严格的，因为正选择通常在短时间内作用于基因的几个位点，并且会被其余位点上的负选择抵消。因此，会使用其它一些方法来计算正选择基因，比如今天小编要说的Site Models。话不多说，下面就来介绍如何利用CODEML中的 Site Models 进行正选择基因分析。

Site Models 简介

Site Models是PAML软件CODEML程序的一个正选择作用分析模型，其主要观点是同一序列不同位点的ω值不同，其中ω = dN/dS，表示非同义/同义替换率。ω比率用于度量正选择作用。简而言之，ω值 < 1，= 1，> 1表示负的纯净选择，中性进化和正选择。然而所有位点的平均ω比率和所有的种系几乎从不 > 1，因为正选择不可能在漫长的时间中作用于所有的位点。因此，真正要探究的只是一些种系和一些位点所受的正选择影响。

在进行Site Models分析时，需要设置control file中的Model=0。Site Models中有多个不同的模型，可由Nssites参数指定，根据不同Model的选择设置不同的值。值得注意的是，以此可以选择多个Site Models。如Nssites=0 1 2 3 7 8。

不同的Site Models 表示什么意思？

1. M0即one-ratio Model，值得是所有位点的ω值是恒定的； 

2. M1表示加假定有一部分位点的ω值为0，其他位点的ω值为1；

3. M2是在M1的基础上增加了第三类ω值，该类ω是通过数据计算得到的，有可能大于1；

4. M3假定所有位点的ω值呈简单的离散分布趋势；

5. M7假定所有位点的ω属于矩阵（0,1）且呈beta分布； 

6. M8是在M7的基础上增加另一类ω值，该值可通过计算得到，可以大于1；

其对应的参数如下：

不同Model的比较可以得到什么样的结果？ 

在Site Models 中，M0表示one ratio for all sites， M3表示所有位点的ω值呈简单的离散分布。对于这两个模型的比较并非用于正选择作用的检测，而是用于位点间ω值是否一致的检测。

M1 and M2 以及M7 and M8是用于正选择作用的检测，作者推荐使用这两组比较进行LRT检验来验证正选择。不过Prof.Yang认为，The M1-M2 comparison 与 the M7- M8 comparison相比，更加的稳定。M7和M8俩模型计算时间会长一些，如果要进行分析的基因较多，可以考虑不比较 M7- M8。

如何检测positive sites？

在CODEML中，positive sites 的检测流程主要如图1所示：

CODEML computation:主要是对control file中的命令值进行设定之后，运行CODEML程序。运行CODEML程序需要三个文件，分别是序列文件（PHYLIP格式），树文件和控制文件。控制文件示例：

      seqfile = Fungi.fasta    * sequence data file name
     treefile = Fungi.tree   * tree structure file name

      outfile = mlc          * main result file name
        noisy = 3   * 0,1,2,3,9: how much rubbish on the screen
      verbose = 0   * 1: detailed output, 0: concise output
      runmode = 0   * 0: user tree;  1: semi-automatic;  2: automatic
                    * 3: StepwiseAddition; (4,5):PerturbationNNI; -2: pairwise

      seqtype = 1   * 1:codons; 2:AAs; 3:codons-->AAs
    CodonFreq = 2   * 0:1/61 each, 1:F1X4, 2:F3X4, 3:codon table
        clock = 0   * 0: no clock, unrooted tree, 1: clock, rooted tree
       aaDist = 0   * 0:equal, +:geometric; -:linear, {1-5:G1974,Miyata,c,p,v}
        model = 0

      NSsites = 0 3 1 2 7 8
                    * 0:one w; 1:NearlyNeutral; 2:PositiveSelection; 3:discrete;
                    * 4:freqs; 5:gamma;6:2gamma;7:beta;8:beta&w;9:betaγ10:3normal
        icode = 0   * 0:standard genetic code; 1:mammalian mt; 2-10:see below
        Mgene = 0   * 0:rates, 1:separate; 2:pi, 3:kappa, 4:all

    fix_kappa = 0   * 1: kappa fixed, 0: kappa to be estimated
        kappa = .3   * initial or fixed kappa
    fix_omega = 0   * 1: omega or omega_1 fixed, 0: estimate
        omega = 1.3  * initial or fixed omega, for codons or codon-based AAs
        ncatG = 10   * # of categories in the dG or AdG models of rates

        getSE = 0   * 0: don't want them, 1: want S.E.s of estimates
 RateAncestor = 0   * (0,1,2): rates (alpha>0) or ancestral states (1 or 2)

   Small_Diff = .45e-6
    cleandata = 1  * remove sites with ambiguity data (1:yes, 0:no)?
  fix_blength = 0  * 0: ignore, -1: random, 1: initial, 2: fixed, 3: proportional

Likelihood ratio test: 即对两个模型进行显著性水平比较，可以使用PAML软件自带Chi2子程序进行计算。先计算两个对应模型 Ln L 差值，并取绝对值后的数值乘以2，即2△Ln L =|Ln L 1-Ln L2|。利用Chi2程序计算P值，命令为：Chi2  2  2.03（2为自由度df，site models中df通常使用2；2.03为2△Ln L）。

输出值 prob <0.05视为显著，可认为该基因受到正选择。

PP value computation：主要是指位点后验概率的计算，该结果是显示在主输出文件 mlc中。标 "*" 号的位点为显著的正选择位点。CODEML程序中常见的计算后验概率的方法有BEB和NEB。与BEB相比，NEB在计算的过程中往往会忽略抽样误差。因此，Prof.Yang建议在读取运算结果时，可以直接将NEB result忽略，但值得注意的是，BEB只能在M2a和M8 model下运行。

参考文献：

Yang Z. PAML 4: phylogenetic analysis by maximum likelihood[J]. Molecular biology and evolution, 2007, 24(8): 1586-1591.

Yang Z. PAML: phylogenetic analysis by maximum likelihood[J]. University College London, London, 2000.

延伸阅读

NCBI批量下载 | 单拷贝直系同源基因 | 做进化树怎么选算法？| p值还是 FDR ?| 勤工俭学好机会