外源插入位置查找好方法
随着基因工程技术的发展，跨物种转基因从而使某个动植物或者微生物具有某种特定的功能，已经成为突破现有传统育种手段和基因工程的有力工具。但是，要想找到转基因后的样品是否转基因成功，再进一步知道转入的外来基因或者片段插入到了基因组的什么位置，都是急需要解决的问题。
传统方法的弊端
传统的方法，根据插入片段设计随机引物来检测转基因片段，检测效率低下且假阳性高。原因是多方面的，首先转基因插入的位点在基因组上的位置未知，其次插入片段有可能断裂，另外还有可能插入基因组的多个位置，这对转基因的鉴定带来很大的麻烦，传统的方法已经不能满足插入位点检测的需要。
NGS技术让检测更加准确
随着技术的进步，利用NGS测序技术查找外源基因插入位置的方法变得简单、高效且准确。下面我们介绍分析的具体方法：
首先，将下机数据进行过滤得到Clean Data；
然后，把reads比对到“被插入物种和插入序列组合在一起的参考基因组”上得到Mapped Data；
接着在比对上的reads中筛选“一半比对到被插入基因上，另一半比对到插入序列上的junction reads”，根据junction reads的比对信息确定插入位置和方向；
最后，对这些reads进行聚类确定插入位置和长度，以及是否存在成对的junction clusters。
分析方法如下图所示：
对junction reads 进行定位聚类并绘制结果图，下图中绿色表示junction reads在插入位点左侧，紫色的在位于插入位点右侧。一般会出现三种情况：
A：表示最理想的结果，在插入位点左右两侧找到junction reads cluster；
B：由于外源插入导致插入位点大片段缺失，导致两侧junction reads cluster 距离较远；
C：表示只找到单侧的junction reads cluster，可能是由于外源插入而导致染色体异位或者重排等。
后续验证实验
知道了外源基因或者片段插入基因组的具体位置，那么我们就可以在插入位点两侧设计pcr引物，用于后续的验证，此标记为共显性标记，对纯合插入和杂合插入个体都能区分。
其中，红色箭头部分由于插入导致片段与野生型相比，片段明显变长。
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参考文献：
Esher SK, Granek JA, Alspaugh JA. Rapid mapping of insertional mutations to probe cell wall regulation in Cryptococcus neoformans. Fungal genetics and biology : FG & B. 2015;82:9-21. doi:10.1016/j.fgb.2015.06.003.
- 发表于 2018-04-22 14:32
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- 分类：软件工具
