基因家族分析发表SCI想必大家都耳熟能详了，1-3分的SCI还是比较好发的，但是要想发高分或者比较好的期刊，文章越来越难发？是你没发现新思路，基因家族分析发2-4分文章简单快速，学习链接：基因家族分析实操课程，仅仅做简单的基因家族分析貌似内容有些单调，那么基因家族分析后续还能通过哪些实验深入挖掘家族基因信息，整理一篇更高质量的论文呢？下面就通过一篇2018年9月10日发表在Frontiers in plant science（中科院分区: 2区；IF=3.678）题为Genome-Wide Identification and Expression Profiling of the TCP Family Genes in Spike and Grain Development of Wheat (Triticum aestivum L.)的文章，一起来学习下基因家族分析后续实验该怎么做！

背景介绍

TCP基因家族是植物中特有的一类转录因子基因家族，参与植物生长发育、抗逆应答等的多个生物学过程。TCP基因家族的进化和功能已在多个物种如苹果、水稻、玉米、金鱼草等有过研究，但未见在小麦中报道；所以作者利用IWGSC发布的小麦最新基因组序列，对TCP家族基因进行全基因组水平的鉴定，并分析了TCP家族基因的结构、染色体位置、系统发生关系、启动子顺式元件分布特点等，并进一步利用RT-PCR、原位杂交、酵母双杂交等实验手段及突变体材料对小麦幼穗和籽粒发育过程中TCP家族基因功能进行了深入研究。

结果展示

1. 小麦中TCP家族基因鉴定、系统发育及分类分析

作者利用水稻和拟南芥TCP蛋白全长序列在小麦中共鉴定到66个TCP家族基因，每个TCP基因均有3个同源基因（A、B、D），如下表（部分展示）：

构建系统发育树及基因结构图，如下图；66个TCP基因划分为2个类型：class I (PCF) and class II（CIN and CYC/TB1）；class I (PCF)包含33 TCP家族成员；class II（CIN and CYC/TB1）包含：12个CYC/TB1-type ； 21个CIN-type。

其中比较特殊的TB1在染色体4和染色体5上分别有一个拷贝，并且每个都有3个同源基因（位于A、B、D亚组）；其中染色体4上的TB1已有报道与花序发育有关，而染色体5上TB1还未有相关报道，作者又用小麦二倍体供体 (Aegilops tauschii and Triticum urartu), 四倍体小麦 (Triticum turgidum)和单子叶植物水稻、玉米、短柄草、高粱的TB1直系同源基因及旁系同源基因构建系统发育树，如下图：所有小麦相关物种均有2个拷贝的TB1，玉米也有2个TB1拷贝，是由于片段重复产生的；其余物种均有1个TB1拷贝。

作者又计算了每对TB1拷贝的Ks and Ka/Ks ，如下如：5对TB1的Ka/Ks均小于1，表明TB1在这5个物种中受到了强烈的正选择压力，复制事件发生在约0.62–0.84 百万年前。 

2. TCP家族基因染色体定位及复制事件

TCP家族基因的染色体位置图及部分TCP家族基因的复制事件，如下图：

3.  TCP家族基因保守motif及结构域分析

共鉴定到10个保守的motif，除了TaPCF1-A、D; TaTCP29-A、B、D这个五个基因外均有保守的motif 1 和 motif 2（Supplementary Figure S1 数据未能找到）；TCP家族基因保守结构域包含Basic、Helix I、 Loop和Helix II 4个motif，并且class I (PCF) 与class II（CIN and CYC/TB1）相比，存在一个4个氨基酸的缺失，如下图：

4. TCP家族基因小RNA靶标位点分析

根据前人报道，作者分析了TCP家族基因中存在的miR319a和miR159a潜在作用靶标位点，如下图：

5. TaTCP基因启动子中顺式作用元件的鉴定

该部分分析了植物生长发育及激素信号相关的顺式作用元件，如生长发育相关的：Skn-1、GCN4、CAT-box 、CCGTCC-box等；激素信号相关：茉莉酸甲酯响应元件CGTCA和TGACG，ABA激素响应元件ABRE，赤霉素响应元件GARE 和 P-box，生长素响应元件TGA, AUXRR core和TGA box。具体见下图：

6. TCP家族基因时空特异性表达分析

2017年作者测过4个时期的幼穗的转录组：double ridge (DR, Waddington scale W2)、floret meristem (FM, W2.5 ∼ 3)、 anther primordium (AM, W3.5 ∼ 4)和 tetrad (TS, W7.5) stages，分析了TCP家族基因时空表达特性，本次鉴定到的TCP家族中的15个TCP基因（31个同源基因）在幼穗中的时空表达模式变化详见下图：

本次实验中作者又通过RT-PCR的方法验证了以上15个TCP基因在W2、W2.5、W3.5和W7.5四个时期的表达模式变化，并且增加了W5.5、W6.5和W8.5三个时间点，以期得到对以上TCP基因在幼穗中表达模式变化更精确的分析。如下图：

由于TCP基因随着幼穗成熟表现出表达量升高趋势，作者为分析TCP基因在幼穗中表达组织特异性，所以选择了花序发育晚期heading date stage (W9.5)阶段，选取rachis、glume、 lemma、 palea、 pistil 和 stamen六个组织部位，检测TCP家族基因表达组织特异性，具体见下图：

为了进一步了解TCP基因是否在未成熟籽粒（immature grain）中表达，作者分析了雌蕊中特异表达的7个TCP基因在发育0、2、4、6、8、10 Day的幼嫩籽粒中表达模式变化，如下图：

7. TCP家族基因原位杂交实验

为确认TCP基因在穗发育早期阶段的组织特异表达，作者选择了4个在W3.5、W5.5和 W6.5三阶段高表达的TCP基因，进行原位杂交实验，分析了TaPCF5、TaPCF6、TaTCP18和TaTCP21在穗发育早期以及TaTCP9在籽粒发育早期的时空表达特性，如下图：

8. TCP家族基因蛋白互作实验

TCP蛋白需形成复合物才能行使功能，作者通过酵母双杂交实验分析了TCP蛋白的交互功能，选择的TCP基因具有高表达和具有相同的表达模式；结果显示TCP蛋白可能是通过彼此间形成同源或异源二聚体行使功能的。

9.  TaTCP9缺失突变四倍体小麦特性

在水稻中，OsTCP19基因是连接外界胁迫和生长发育的关键细胞信号节点，在小麦中TaTCP9与OsTCP19在系统发育树上位于同一枝，但TaTCP9及其同源基因的功能仍未见报道。作者首先分析了TaTCP9的时空表达模式，发现其在雌蕊W9.5阶段高表达；在未成熟籽粒发育过程中，TaTCP9在2 Day表达达到高峰后表达下调（数据见figure 9、10）。原位杂交实验显示TaCP9基因表达阶段是籽粒发育2、4和 6 Day，表达位置主要在胚乳转移细胞和珠心突起转移细胞（Figures 13A–D）。作者还发现在四倍体小麦和六倍体小麦中TaTCP9表达模式是一致的，但两个A基因组上提前终止的TaTCP9突变四倍体小麦却表现出穗和籽粒长度增加，这表明TaTCP9在小麦籽粒发育过程中可能确实发挥重要作用。如下图：

总结

本文中前部分内容如家族基因鉴定、基因结构分析、系统发育树、基因重复加倍事件、motif及保守结构域分析、顺式作用元件分析以及基因的表达模式变化分析均是基因家族分析类SCI常见的分析内容，本文之所以能发表到Frontiers in plant science，小编认为还是作者添加了一系列实验手段进一步阐明TCP基因家族在小麦穗及籽粒发育过程中的作用的缘故，像原位杂交、酵母双杂交以及筛选到TaTCP9突变体更是难得。

当然作者熟读文献及对自己研究领域的了解也是我们应该学习的地方！想研究基因家族的小伙伴们千万不要错过这篇好文章吆！赶紧下载原文学习吧！喜欢小编解读的这篇文章的你，请点下方推荐！

1. 文章越来越难发？是你没发现新思路，基因家族分析发2-4分文章简单快速，学习链接：基因家族分析实操课程

2. 转录组数据理解不深入？图表看不懂？点击链接学习深入解读数据结果文件，学习链接：转录组（有参）结果解读；转录组（无参）结果解读

3. 转录组数据深入挖掘技能-WGCNA，提升你的文章档次，学习链接：WGCNA-加权基因共表达网络分析

4. 转录组数据怎么挖掘？学习链接：转录组标准分析后的数据挖掘

5. 微生物16S/ITS/18S分析原理及结果解读

6. 更多学习内容：linux、perl、R语言画图，更多免费课程请扫描下方二维码：

小麦TCP基因家族文献原文下载地址：https://www.omicsclass.com/article/542