前言

只针对一个具体的小问题，利用RNA-seq进行分析也能发高分文章？当然可以！

这次跟大家分享的文献就是针对水稻旗叶中磷的再运转问题开展的实验(发在Plant Biotechnology Journal上），利用RNA-seq数据分析相关基因的表达情况及功能的。

材料与方法

材料培育：水稻（温室条件，特定处理的土壤条件，进行生长控制）。

磷含量测定：取开花后0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33天（DAA，day after anthesis）的水稻旗叶组织进行磷含量测定。

测序: 取6 DAA、15 DAA的水稻旗叶，每组三个生物学重复，共6个sample，进行RNA-seq。 

结果分析

基于磷含量变化以及测序数据，对水稻灌浆过程中处于磷饥饿状态下旗叶中磷的再运转进行相关分析。

（1）磷含量测定

水稻灌浆早期，旗叶中磷浓度基本维持稳定，然而9 DAA时，浓度显著下降。在9 DAA 到12 DAA的过程中，浓度就由3.5 mg/g降低到了2.5 mg/g左右（下图），说明12 DAA时，旗叶开始为种子提供发育所需的磷。

Tips:

基于磷浓度变化，选择两个时间点的旗叶进行RNA-seq。第一个是6 DAA，此时旗叶中磷浓度相对稳定，旗叶还没有作为磷源为水稻种子发育提供磷，而第二个15 DAA，此时相对于0 DAA，P浓度下降了33%左右，很明显它已经作为磷源开始工作。

（2）基因差异表达分析及功能注释

使用参数：FDR<0.05,以及|log2FC|>1.5 进行差异表达基因筛选，得到1643 DEGs，其中1180 DEGs注释到GO数据库,分布于263 GO terms中，富集结果如下图：

上调 DEGs 显著富集的GO term分属生物过程和分子功能两大类，其中生物过程类包括磷代谢，蛋白修饰转运，这一结果与分子功能中富集到的显著GO term（磷酸转移酶、激酶以及转运的功能）一致。

下调 DEGs 显著富集的GO term包含转录和翻译（生物过程类）、RNA结合、核糖体的构成（分子功能类）等。研究还发现，存在几个涉及光合成与光系统功能的基因，表达量下调，被认为和质体以及细胞器相关，并且在GO 富集结果的细胞组分部分得到了佐证。

（3）已报告相关基因分析

通过文献阅读，筛选115个和磷饥饿有关的基因进行后续分析，并作为重点关注对象。

对115个PSR基因进行表达量分析，结果显示磷的转运体编码基因OsPT21，在两个时间点都有非常高的表达量，此外有14个基因在两个时间点都没有表达。

在这些基因中筛选到38 DEGs，26个上调基因包括了OsPHO1、OsPHO2（磷饥饿信号相关），OsSPX1、OsSPX2（P平衡相关），紫色酸性磷酸酶（PAP）OsPAP1d、 OsPAP3c、OsPAP10a，以及磷转运体OsPT5、OsPT19、OsPT20等等。

（4）OsPAP,OsPT及OsSP基因家族分析

基于上一步分析结果,重点研究了OsPAP, OsPTand OsSP domain 基因家族的表达情况(包括测序结果中的以及其他文献中提到的基因），如下图：

图注：（a）图对应的是OsPAP，(b)图对应的是OsPT，而(c)对应的是OsSP以及它的一个转录因子OsPHR2。

OsPAP中存在几个显著性上调的基因，包括OsPAP9b、OsPAP15以及 OsPAP26。OsPT中OsPT21和 OsPT24虽然没有差异表达，但是表达量非常高。部分OsSP基因存在差异表达，但是其转录因子OsPHR2没有差异表达。

（6）磷代谢相关的生物通路

利用KEGG进行了注释，筛选涉及磷代谢和回收过程的所有基因，并针对DEG进行重点分析。

35个DEG涉及到脂质代谢，包括了上调的GDPD、DGDG、MGDG、SQD2等，这些基因可以促进半乳糖合成。同时，部分参与脂质降解的基因也出现了上调。而一些涉及磷脂等合成的基因出现了下调。

50个DEG涉及核苷酸代谢，包括了RNA转运和降解。6个上调的DEG与RNA降解直接相关，而下调的基因主要涉及的是核酸的合成。由此可见，在叶片衰老过程中，核酸存在明显的降解。

结语及启发

在水稻灌浆过程中，旗叶衰老，如果植株进入磷饥饿状态，此时植物体就会调动叶片中的磷，以满足种子的正常生长需求。而在这一过程中，磷饥饿响应基因在磷的再运转过程中发挥了重要作用。

该文章涉及实验并无难点，其研究思路却值得我们学习，先通过理化实验（磷含量测序）确定转录组实验的取样点，在常规分析的基础上对其他文献中已报道的相关基因进行分析。可见即便是常规的实验技术，只要找对了研究方向，做好充分的调研准备，一样是能够发高分文章的。

参考文献：

Jeong K, Baten A, Waters D L E, et al. Phosphorus remobilization from rice flag leaves during grain filling: an RNA‐seq study[J]. Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(1):15-26.