前言

利用不同的测序数据进行联合分析是进行转录调控研究常用的方法，不同的实验结果相互印证，可以探究生物体内基因表达调控更深层次的秘密，高分文章当然会手到擒来！

下面通过一篇《Plant Biotechnology Journal》上的文章—— 转录组、sRNA及降解组的联合应用，研究Cd胁迫下植物修复的基因调控网络，来看看这类实验的研究思路。

实验材料与方法

材料:生长在废弃锌、铅矿区的东南景天（Sedum alfredii，对Cd等有非常强的耐性和积累能力）；

处理：使用 400 μM CdCl2 处理实验材料；

采样：在处理后多个时间点（0 h、0.5 h 、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h ）对根、茎、叶三个部位采样，将同一时间点的三种组织进行混样并提取RNA；

测序：对每个样品进行转录组、sRNA、降解组测序。

实验结果分析

三种测序数据联合分析，以期揭示Cd胁迫下东南景天自我修复过程中的调控网络。

（1）转录组分析

对转录组数据进行组装得到unigene 87721 个，平均长度586 bp（结果如下表）。利用Blastx对unigene，在nr数据库中进注释，并进行了基因差异表达分析。这一部分的功能注释以及差异表达分析，为后续miRNA的靶基因相关分析奠定了基础。

（2）miRNA鉴定及差异表达分析

对sRNA测序数据进行分析，共预测到356个miRNA。其中260个pre-miRNA 对应到299个已知的、成熟的miRNA。另外40个 pre-miRNA对应57个成熟的、新miRNA。

差异表达分析结果显示，在处理后不同时期发生表达量变化的miRNA有153个，改变筛选条件（丰度>10)，有79个miRNA差异表达，其中67个为已知的，12个为新的miRNA。通过表达谱热图可以看出同一家族的miRNA,绝大部分表达情况相似。新的miRNA有10个在Cd处理下上调，另外两个下调（如下图）。

针对153个差异表达的miRNA, 分析了其不同处理时间下的上下调分布情况（较之对照组0 h），在48 h 上调的miRNA 最多，达到了45个如下图）。

（3）降解组进行靶基因预测、功能注释及富集分析

根据180个已知的miRNA预测到722个靶基因，同时根据57个新miRNA中的14个miRNA预测得到32个靶向转录本。值得注意的是ptc-miR171i-p3_1ss21TG 靶基因最多，可以剪切47个，而有11个miRNA仅靶向剪切了同一个转录本，而这个转录本可能是涉及水解酶活性的蛋白。

针对754个靶基因进行了功能注释和富集分析，发现与重金属胁迫响应或金属转运体相关的GO terms富集显著。

（4）miRNA表达谱与靶基因联合分析

通过转录组测序数据和sRNA测序数据，联合分析了miRNA与其靶基因的差异表达情况。结果表明342个靶基因在Cd处理下出现了差异表达（部分结果如下图所示）。

针对部分基因进行RT-qPCR的验证，绝大部分差异表达的miRNA及其靶基因的表达情况与高通量测序的结果相似。12组miRNA-target，有10组呈现出miRNA与target的负相关关系，由此可见这些miRNA抑制了其靶基因的表达，如下图：

（5）共表达网络分析

为了更好的揭示东南景天中Cd处理下的调控机制，作者利用转录组数据与sRNA测序数据进行了WGCNA (加权基因共表达网络）分析，以期能够挖掘不同的基因共表达的模块。分析获得60个基因共表达模块，结果网络最终由31个不同的模块组成。

之后基于WGCNA的分析结果，选取了与重金属胁迫响应相关的两个hub基因AR4和AAP3，绘制了相应的子网络图（如下图）。

这两个hub基因分别是PC-5p-3760_2402 与han-miR3630-3p_L-2R-1_1ss21TA两个miRNA的靶基因，子网络的组成基因主要涉及了信号转导、转录因子、抗氧化相关基因、细胞程序性死亡以及金属转运体。

结语

作者通过对三种测序数据的联合分析，揭示了miRNA与target gene在Cd胁迫下的调控作用，并且在实验结果中发现了两个重要的hub基因AR4和AAP3，可能会对东南景天在Cd处理下的植物修复有重要作用。

参考文献：
Han X, Yin H, Song X, et al. Integration of smallRNAs, degradome and transcriptome sequencing in hyperaccumulatorSedum alfrediiuncovers a complex regulatory network and provides insights into cadmium phytoremediation:[J]. Plant Biotechnology Journal, 2016, 14(6):1470-1483.