上一期，我们一起了解了积雪草苷合成过程中糖基化反应的转录组文章，今天我们来看第二篇同样以这个转录组数据为基础的第二篇SCI文章，这一次作者关注点更加细致，下面听我娓娓道来：积雪草酸是由香树脂醇α-amyrin在C-2α, C-23 和C-28三个位置进行3次羟基化形成的。（红色框内）

前人已经报道细胞色素P450亚家族CYP716中CYP716A83和CYP716A86单氧酶催化了C-28位置的羟基化，CYP716C11负责C-2α位置的羟基化，而C-23位置则无报道，所以本文重点阐释C-2α位置的羟基化问题。同样作者在该文章依然借助了qRT-PCR、异源共表达、气质联用（GC-MS）等手段，下面一起来看看：

1. 香树脂醇α-amyrin（底物）合成基因CaDDS的验证

由于前人对合成α-amyrin的基因CaDDs报道有争议，所以作者通过在GIL77酵母突变株中过表达CaDDs，并通过质谱鉴定生成物，验证了CaDDs合成α-amyrin的正确性。接下来将用CaDDs作为底物α-amyrin提供者与候选P450单氧酶基因进行共表达试验。

2. p450基因的筛选

作者通过对茉莉酸甲酯处理后的积雪草叶片转录组组装出的unigenes进行同源比对，共筛选出149 unigenes被注释为P450酶基因， 23个具有完整开放阅读框，其中13个在其他物种中报道过与次生代谢有关的被划分到P450家族不同的亚家族。

接下来作者又在茉莉酸甲酯处理后的发根培养物中用RT-PCR对上述13个与次生代谢相关的P450酶基因进行表达模式变化分析，结果13个基因中只有8个在处理后12h开始表现出上调表达；进一步用QRT-PCR检测这8个上调表达基因，又排除掉cyp72A309这个酶基因。

由于积雪苷只要是在叶子中合成，根据RNA组织特异性表达原则，作者把在叶中特异表达的P450酶基因作为优先关注的候选基因，最终选定CYP716A83, CYP716A85, CYP714E19 和CYP736A118这4个基因作为P450酶候选基因。

将积雪草所有的P450酶基因按序列相似性构建进化树，可以看到CYP716A83与已知参与C-28位置的羟基化的P450基因聚在一起；CYP716A85则被重新定义为CYP716E41，参与C-6位置的羟基化；而CYP714E19 和 CYP736A118才是最有可能参与C-23位置羟基化的酶。

3. 共表达系统检验候选P450酶催化活性

酵母共表达系统检测候选基因酶催化活性，分两轮试验进行，第一轮是单个候选酶基因与CaDDs的共表达；第二轮是多个候选酶基因与CaDDs的共表达，两轮实验产物均以气质联用（GC-MS）进行检测鉴定。

CaDDs与CYP716A83酵母系统共表达，生成物鉴定显示CYP716A83酶能够将多种三萜类包括α/β-amyrin C-28位置甲基分步氧化至羧基，生成三萜类酸。

CaDDs分别与其他三个候选P450酶基因酵母共表达体系均能生成三萜醇类，主要是β-amyrin 和α-amyrin，但未发生进一步氧化。

第二轮实验中以CaDDs和CYP716A83分别与CYP716A85、CYP714E19 、 CYP736A118构建共表达体系，结果显示CaDDs、CYP716A83和CYP716A85；CaDDs、CYP716A83和CYP736A118两组合均生成三萜类产物，并未产生进一步的氧化产物。但是CaDDs、CYP716A83和CYP714E19组合可以生成多种C-23被氧化成羟基的三萜类化合物，并且CYP714E19可以催化熊果纯、高根二醇、熊果酸、齐墩果酸，但是不能单独催化香树脂醇（amyrin）。

CYP714E19单独不能催化amyrin，但与CYP716A83一起却可以催化amyrin的C-23羟基化，说明有可能CYP716A83催化的C-28位置生成三萜类酸，发生在C-23羟基化之前。

最后作者还提出积雪草中不仅存在乌苏烷类型三萜皂苷，还可能存在齐墩果烷类皂苷，他们共享2α-C, 6β-C和 23-C等功能基团，只是本实验数据的局限性，要想进一步确认还需更多的实验数据支持。

参考文献：

Kim OT at all. A Novel Multifunctional C-23 Oxidase, CYP714E19, Is Involved in Asiaticoside Biosynthesis. Plant Cell Physiol. 2018 Mar 22.

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