转录组测序分析水稻旱作的重要基因

转录组测序分析水稻旱作的总要基因

随着气候的改变、水资源短缺以及人口的增长，进行作物品种改良，使其适应环境变化，对可持续农业具有重要的作用。水稻是重要的粮食作物，它包括了传统的水作水稻（水稻）和旱作水稻（陆稻）等。二代测序数据如何分析水稻旱作适应的分子机制呢？下面就给大家讲解一篇相关文献，帮助大家了解！

材料方法

材料：水稻（Oryza sativa L.) 两个品种，CR Dhan 202 (AAC，陆稻)，BPT 5204 (NAC，水稻)。
处理：各品种分别进行旱作（土壤湿润，透气排水）和水作（水淹高度2.5 cm）培养，温室条件（28/20 °C day/night）。
取样：萌发后（60-70 days）进入圆锥花序期，每种处理分别采取嫩芽和根组织，各三个生物学重复。

测序：生物学重复混样提取RNA进行测序。
测序样品对应：BPT 5204 Aerobic Shoot，BAS；CR Dhan 202 Aerobic Shoot，CAS；BPT 5204 Anaerobic Shoot，BFS；CR Dhan 202 Anaerobic Shoot，CFS；BPT 5204 Anaerobic Root， BFR；BPT 5204 Aerobic Root ，BAR；CR Dhan 202 Aerobic Root， CAR；CR Dhan 202 Anaerobic Root ，CFR。

测序数据

八个测序文库的测序数据见下表，完成数据预处理并将clean reads和参考基因组比对，共1.38 billion的clean reasd比对上参考基因组，之后计算转录本的表达量FPKM，以便进一步分析。

差异表达分析

对ACC 和NAC不同的处理方式的样本间进行差异分析，共四组差异比较（BAS vs. CAS、BAR vs. CAR、BFS vs. CFS、BFR vs. CFR），差异分析的阈值为FDR<0.005 & |log2FC|≥1.5。

结果发现：旱作条件下，根组织的差异转录本数量（DETs，BAR vs. CAR）高于水作条件下DETs（BFR vs. CFR），嫩芽组织相反，旱作条件下的DETs（BAS vs. CAS）低于水作条件下的DETs （BFS vs. CFS），具体见下图，实验基于根部差异分析共筛选出了237个DETs，而基于嫩芽组织共获得了188个DETs。

功能注释与富集

针对DETs进行了功能注释和富集分析，部分GO注释结果见下图，富集分析发现，涉及缺水响应 (GO: 0009414), 冷 (GO: 0009409) 以及胁迫相应 (GO: 0006950)，核酸结合转录因子 (GO: 0001071) 以及氧化还原酶活性 (GO: 0016491)，细胞外区域（GO:0005576）和胞质膜结合囊泡（GO:0016023）出现了明显富集。

KEGG富集分析显示，旱作条件下，根部组织的DETs明显富集于代谢以及二级代谢合成等相关途径，嫩芽组织则主要涉及脂肪酸水解、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢等。

此外，利用MapMan对这些DETs进行代谢通路分析，重点针对旱作条件下的DETs在代谢和二级代谢合成进行了分析，部分结果见下图。

转录因子、转运体、根性状相关基因

针对DETs分析其是否属于转录因子（TFs）、转运体、根性状相关基因等。DETs转录因子分析结果显示：嫩芽组织，9个TFs（DETs）仅旱作条件下出现表达（较之水作条件），其中7个TFs在AAC中较之NAC显著性上调(BAS vs. CAS)，这其中的5个（MADS4， MADS5， MADS6， MADS7 and putative WRKY transcription factor 6）仅在AAC中。根组织进行了类似分析，也有5个TFs（ MADS15， MADS26， Dehydration-responsive element-binding (DREB) family protein， DREB1F and DREB1C）仅在ACC中（见下图）。

而转运体的分析方法类似转录因子，重点分析了离子转运体，结果见下图。此外还分析的根性状相关的基因，并基于以上的分析筛选的基因进行后期的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验。

可变剪切

基于可变剪切对于基因表达调控的影响，实验重点分析了旱作条件对可变剪切是否产生影响，分别分析实验样本中的五种可变剪切事件，结果显示，旱作条件下，无论是根组织还是嫩芽组织中的可变剪切事件都明显高于水作条件。

其他

实验还涉及了其他的分析，譬如，为鉴定是否存在基因属于已报导缺水条件相关QTLs等，选择ACC中上调DETs于QTARO数据库进行in-silico mapping，结果发现MADS4基因比对上了两个根性状相关的QTLs，还涉及其他的一些基因和相关的QTLs等等。
此外，为验证测序和分析结果，基于此前的分析，针对重要的基因进行了qRT-PCR，并与测序计算的表达了量进行了拟合分析，结果见下图（a：BAS vs. CAS ，b：BAR vs. CAR)：

结论

作者针对陆稻和水稻品种进行不同栽培处理，分析不同品种间的差异转录本，并针对这些差异的转录本挖掘和根系性状、缺水相关的基因，重点探索了这些基因可能涉及到的功能，从而阐述水稻旱作的分子机制。

参考文献：

Amol S. Phule, Kalyani M. Barbadikar, Sheshu Madhav Maganti, P. Seguttuvel, D. Subrahmanyam, M. B. B. Prasad Babu & Polumetla A. Kumar RNA-seq reveals the involvement of key genes for aerobic adaptation in rice. Scientific Reports volume 9, Article number: 5235 (2019)