细胞死亡的方式主要有两种，包括细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死是早已被认识到的细胞死亡方式，而细胞凋亡是近年来逐渐被认识且越来越受到重视的细胞死亡方式。两种死亡方式最重要的区别是细胞坏死会释放出细胞内溶物，引起炎症反应，而细胞凋亡不会暴露细胞内溶物，一般被吞噬细胞吞噬清除，不引起炎症反应。

　　细胞凋亡(apoptosis)指为维持机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。凋亡的发生并不是一蹴而就，因此，针对不同凋亡事件的检测方法众多种多样，常用的方法包括细胞的形态学观察，磷脂酰丝氨酸外翻分析，检测线粒体膜势能，检测片段化的DNA所采用的Tunel法，Caspase活性检测，凋亡相关蛋白的检测等。

　　今天，我们讨论的方法是——磷脂酰丝氨酸外翻分析，也就是通过Annexin V和PI的联合使用，最终可判断细胞凋亡的各个阶段，这个方法是目前非常热门的研究方法，被大家广泛使用。

　　Annexin V/PI法双管齐下优势明显！

　　正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)位于细胞膜的内表面，细胞凋亡时，细胞膜发生变化，PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。

　　annexinV是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白，annexinV可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS，而活细胞的PS位于细胞膜的内表面，无法与annexinV特异性结合。

　　所以可以用FITC偶联的annexinV鉴别凋亡细胞和活细胞。

　　坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，annexinV也能识别坏死细胞表面的PS，所以annexinV无法区分坏死细胞和凋亡细胞。

　　而PI染料能够与细胞内的DNA结合，区分坏死细胞和活细胞。凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被FL2或FL3通道接收。

　　所以annexinV和PI同时使用，就可以双管齐下，区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，这就是annexinV/PI双染色法检测细胞凋亡的原理。

　　Annexin V和PI联用检测细胞凋亡示意图如下：

　　细胞消化重悬后，加入Annexin V和PI以及染色Buffer，正常细胞不会被Annexin V和PI标记上。

　　早期凋亡的细胞，膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻(图中粉色结构)，此时磷脂酰丝氨酸会和Annexin V结合。

　　晚期凋亡的细胞，膜结构破损，此时PI会进入细胞，故晚期凋亡的细胞会被Annexin V和PI标记上。

　　Procell Annexin V-FITC/PI检测试剂盒实验效果图如下：

　　Jurkat细胞用1μM喜树碱(Camptothecin) (左) 或未加药 (右) 处理4 h，Annexin V-FITC/PI检测试剂盒染色后FCM检测。Annexin V-FITC单阳为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞，PI单阳细胞为裸核细胞。

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