重测序大家都不陌生，它是检测样本基因组变异（SNP，indel，SV，CNV）的主要手段之一，有了这些变异信息，后续可以做很多分析工作，例如: 遗传群体可以进行遗传图谱构建、BSA分析等；大样本量自然群体，可以进行群体遗传进化分析等。今天，小编先给大家群体遗传进化分析内容中的进化树构建；教您如何利用重测序获得的SNP数据构建系统进化树，关于进化树的构建原理见：进化树构建原理。

构建进化树的软件

构建进化树的方法和软件很多，前面我们讲解构建进化树的原理时提过，最准确的方法为贝叶斯方法，但是贝叶斯的方法计算量太大太耗时，对于大量的数据不适用，其次就是最大似然法，这里我们解释三种利用最大似然法构建进化树的软件：fasttree，iqtree2，RAxML-ng.输入的数据为做群体遗传进化得到的SNP数据。


数据准备做完重测序分析后，我们可以得到包含 SNP的变异结果vcf文件作为输入文件。详见课程：重测序数据分析课程，然后利用omicsclass/pop-evol-gwas:v1.3 镜像进行前期数据准备与后续进化树构建分析：

#运行环境准备：docker镜像启动
#镜像下载：
docker pull omicsclass/pop-evol-gwas:v1.3
#启动遗传进化镜像
docker run --rm -it -m 4G --cpus 1  -v D:\pop:/work omicsclass/pop-evol-gwas:v1.3

#对vcf文件进行数据过滤
vcftools --gzvcf all.varFilter.vcf.gz --recode --recode-INFO-all --stdout     --maf 0.05  --max-missing 0.7  --minDP 4  --maxDP 1000      \
    --minQ 30 --minGQ 0 --min-alleles 2  --max-alleles 2 --remove-indels |gzip - > clean.vcf.gz

#利用tassel软件对文件进行排序
run_pipeline.pl -Xmx30G  -SortGenotypeFilePlugin -inputFile clean.vcf.gz \
    -outputFile clean.sorted.vcf.gz -fileType VCF

#vcf文件格式转换成Phylip格式，用于后续构建进化树
run_pipeline.pl  -Xmx5G -importGuess  $workdir/00.filter/clean.sorted.vcf.gz  \
    -ExportPlugin -saveAs supergene.phy -format Phylip_Inter

1. FastTree 构建进化树

FastTree 是基于最大似然法构建进化树的软件，它最大的特点就是运行速度快，支持几百万条序列的建树任务。但是fasttree不支持bootstrap检验以及支持的替换模型有限。官网如下：http://www.microbesonline.org/fasttree/

替换模型选择

FastTree 支持核酸和蛋白的进化树构建，对于核酸，可选的替换模型包括以下几种：JC（Jukes-Cantor）、GTR（generalized time-reversible），默认的模型为JC。对于蛋白质，可选的替换模型包括以下几种：JTT (Jones-Taylor-Thornton 1992)、LG(Le and Gascuel 2008)、WAG(Whelan & Goldman 2001) 默认的模型为JTT。FastTree要求输入的多序列比对结果为FASTA或者Phylip格式。
构建进化树命令举例：

fasttree -nt -gtr  supergene.fa   >  fasttree.nwk

FastTree 其他命令举例：

#对于蛋白质的进化树构建，基本用法如下
fasttree protein.fasta > tree
#也可以选择LG或者WAG替换模型，用法如下
fasttree -lg protein.fasta > tree
fasttree -wag protein.fasta > tree
#对于核酸序列，基本用法如下
fasttree -nt nucleotide.fasta > tree
#也可以选择GTR替换模型，用法如下
fasttree -nt  -gtr nucleotide.fasta > tree

2. IQ-tree 构建进化树

IQ-tree也是一款最大似然法构建进化树的软件，目前IQ-tree已经更新到2.0版本功能和性能也有很大的提升，主要有四大功能，高效建树（efficient tree reconstruction），模型选择（modelfinder: fast and accurate model selection），超快bootstrap（ultrafast bootstrap approximation），大型数据（big data analysis），以上特点特别适用于高通量测序的大量SNP构建进化树。

模型选择

构建进化树有很多模型对于初学者往往不知道那种模型最适合，iqtree提供自动模型选择功能，使用的软件为modelfinder。Modelfinder是一款速度超快的自动最佳模型选择软件。其在保证准确性的情况下，速度上比jmodeltest（针对DNA）和prottest（针对蛋白）要快100倍（ModelFinder is up to 100 times faster than jModelTest/ProtTest.），使用命令举例：

#自动选择最佳模型并构建进化树：-m MFP
iqtree -s supergene.phy -m MFP
#只是想找最佳模型不构建进化树：

iqtree -s example.phy -m MF
#查找模型计算过程：


ModelFinder will test up to 546 protein models (sample size: 36415) ...
 No. Model         -LnL         df  AIC          AICc         BIC
  1  LG            10134094.366 349 20268886.731 20268893.505 20271854.186
  2  LG+I          10133927.677 350 20268555.354 20268562.167 20271531.312
  3  LG+G4         10043239.052 350 20087178.104 20087184.917 20090154.062
  4  LG+I+G4       10043175.024 351 20087052.048 20087058.900 20090036.508
  5  LG+R2         10063911.721 351 20128525.442 20128532.294 20131509.902
  6  LG+R3         10045448.117 353 20091602.235 20091609.165 20094603.701

MFP为ModelFinder Plus的缩写，该参数使程序执行ModelFinder选择最适模型并完成建树分析。ModelFinder为许多不同的模型计算初始简约树的逻辑概率，并产生Akaike information criterion (AIC),* corrected Akaike information criterion* (AICc), and* the Bayesian information criterion* (BIC)三个结果标准值，通常ModelFinder选择BIC分数最低的模型（当然也可以指定AIC和AICc通过指定选项-AIC或者-AICc)。如果你想节约时间，可指定选择的模型及编码参数，例如:从WAG ,LG ,JTT 核苷酸替代模型里选一个: -mset WAG,LG,JTT；在+G和+I，以及+I+G三个里面选择rate ：-mrate G,I,I+G；heterogeneity参数：-mfreq FU,F命令行如下：

iqtree -s example.phy -m MPF -mset WAG,LG,JTT  -mrate G,I,I+G -mfreq FU,F

指定模型参数设置格式：-m MODEL+FreqType+RateType，

MODEL：model name
+FreqType：(可选项)frequency type
+RateType：(可选项)rate heterogeneity type

替换模型MODEL包括：

• DNA模型:

JC/JC69, F81, K2P/K80, HKY/HKY85, TN/TrN/TN93, TNe,
K3P/K81, K81u, TPM2, TPM2u, TPM3, TPM3u, TIM, TIMe,
TIM2, TIM2e, TIM3, TIM3e, TVM, TVMe, SYM, GTR and 6-digit

• 蛋白质模型：

BLOSUM62, cpREV, Dayhoff, DCMut, FLU, HIVb, HIVw, JTT,
JTTDCMut, LG, mtART, mtMAM, mtREV, mtZOA, mtMet, mtVer,
mtInv, Poisson, PMB, rtREV, VT, WAG

+FreqType碱基使用偏好：Base frequencies 可选设置：

每个核苷酸位点上的替代是随机发生的，则A,T,C,G出现的频率应该大致相等。实际情况：DNA受到自然选择的压力，各个位点的碱基出现频率并不相等。

+RateType：rate heterogeneity across sites可选设置：

指定替换模型构建进化树命令举例：

iqtree -s example.phy -m TIM2+I+G

Bootstrap法评估分支支持度

真实的进化信息只有一个，而我们总是拿着有限的序列信息，希望去获得他。能否获得他，是一个问题。而我们使用的序列信息是否能真实且稳定地反应一个进化信息，那么是另外一个事情。bootstrap法常用的，尤其是ML法构建进化树上，分支可靠性检验方法。但是这个计算逻辑最大的问题在于，抽样重新跑，抽样再重新跑，不断重复，直到收敛或者是到指定的比如1000次。计算量大，耗时长。IQ-tree的作者团队在前述提出了一个快速的BS方法，最后整合到IQ-tree中。使用的方式是

iqtree -s example.phy -m TIM2+I+G -b 1000

超快（ultrafast bootstraping）

大概是IQTREE的精髓所在。顾名思义，ultrafast bootstrap approximation的特点就是超快。这里涉及到的细节，感兴趣的读者可以参见IQTREE的开发者写的几篇文章。作者认为，UFBoot is 10 to 40 times faster than RAxML rapid bootstrap and obtains less biased support values。

iqtree -s example.phy -m TIM2+I+G -B 1000

除ultrafast bootstrap之外，IQTREE还提供了以下检验树的拓扑结构可信度的方法。

• -alrt：SH-aLRT检验(4)，没记错的话FastTree2使用的就是这个吧？
• -abayes：approximate Bayes test，由瑞士苏黎世应用科学教授Maria Anisimova提出(5)
• -lbp：fast local bootstrap probability method，由Adachi and Hasegawa提出（http://www.is.titech.ac.jp/~shimo/class/doc/csm96.pdf）

iqtree -s example.phy -m TIM2+I+G -B 1000 -alrt 1000

如果你指定了多个检验方法，那么其结果会在树里（.treefile）呈现出来，不同检验所得数值用斜线隔开，比如：((a,b)100/98:0.1,c:0.2)90/95最后，iqtree做群体遗传进化构建进化树推荐命令：

iqtree2 -s supergene.phy -st DNA -T 2  -mem 8G \
    -m  GTR  -redo \
    -B 1000 -bnni \
    --prefix iqtree 

3. RAxML 构建进化树

RAxML是最大似然法（maximum likelihood）建树的经典工具，其由来自德国海德堡理论科学研究所（Heidelberg Institute for Theoretical Studies）的Alexandros Stamatakis开发,最新已经更新了版本RAxML-NG，支持的替换模型更多，运行速度更快。

RAxML 建树原理

RAxML采用最大似然法建树，即将系统树的拓扑结构、分支长度及进化模型等的全部或者部分作为需要估计的参数，在给定的数据集及进化模型的基础上，用最大似然法的标准-似然值最大化来估计这些参数。首先，要选择进化模型，以简约树或者联接树为基础，采用似然法估计模型中各个参数。设置好参数后，以简约树或者联接树作为起始树，进行似然分析，最后用统计学方法从多个似然树中寻找最佳得分树。

RAxML-NG 使用

RAxML软件支持输入文件的格式可以是比对好的fasta格式或者phylip格式，例如DNA比对序列，核苷酸替代模型为GTR，rate heterogeneity设置为gamma分布，不做bootstraping，命令如下：

raxml-ng  --msa supergene.phy --model GTR+G  --prefix raxml_tree     --threads 2 --seed 123

如果是建树和bootstrap一起做，可以加--all参数一步完成：

raxml-ng  --msa supergene.phy --model GTR+G  --prefix raxml_tree --threads 2 --seed 123   

关于raxml-ng模型的设置与iq-tree类似，支持很多种个性化的模型设置：

详细设置方法见：https://github.com/amkozlov/raxml-ng/wiki/Input-data#evolutionary-model

更多生物信息课程：https://study.omicsclass.com/index