离子交换层析(IEX)是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。IEX有两种类型：阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液pH值高于此IP时，蛋白带负电（阴离子）；当pH值低于此IP时，蛋白带正电（阳离子）。下面主要介绍离子交换色谱操作中应注意的一些具体问题。

1.色谱柱

离子交换色谱应根据分离样品的数量选择合适的色谱柱，用于离子交换的色谱柱一般又厚又短，不宜过长。直径和柱长的比例通常在1:10到1:50之间，色谱柱应垂直安装。安装立柱时，立柱应平整，不得有气泡。

2.平衡缓冲器

离子交换色谱的基本反应过程是离子交换剂与待分离物质和缓冲液中离子的交换，因此离子交换色谱中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和pH的选择对分离效果有很大影响。

平衡缓冲液是指离子交换柱加载后和样品加载后用于平衡离子交换柱的缓冲液。选择平衡缓冲液的离子强度和pH首先确保待分离的单个物质（如蛋白质）的稳定性。其次，要使每种待分离物质与离子交换剂有适当的组合，并尽量使样品与待分离杂质与离子交换器的组合有更大的差异。通常，待分离的样品与离子交换器具有更稳定的组合。并尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在某些情况下（如污水处理），杂质可以与离子交换器牢固结合，样品与离子交换器结合不稳定，也可以达到分离的目的。另外，要注意平衡缓冲液不能与离子交换剂离子有很强的结合力，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液可以直接去除大量杂质。并使以下洗脱具有良好的效果。如果平衡缓冲液不合适，可能会给后续洗脱带来困难，无法获得良好的分离效果。

3.样品交付

负载离子交换色谱时，应注意样品液的离子强度和pH值，负载量不宜过大，一般以1-5%的柱床体积为宜，这样样品才能吸附在色谱柱的上层，分离效果更好。

4.洗脱缓冲液

梯度洗脱通常用于离子交换色谱，通常有两种方法来改变离子强度和改变pH。改变离子强度通常是通过在洗脱过程中逐渐增加离子强度来实现的，从而洗脱掉与离子交换剂结合的各种组分；对于pH变化的洗脱，阳离子交换剂通常为从低到高的pH洗脱，阴离子交换剂通常是从高到低的pH洗脱。由于pH可能对蛋白质稳定性有很大影响，因此通常使用具有不同离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱装置介绍较早，可以有线性梯度、凹梯度、凸梯度和分级梯度洗脱方法。通常，线性梯度洗脱具有更好的分离效果，因此通常使用线性梯度洗脱。

洗脱液的选择也是为了确保所有待分离的组分在整个洗脱液梯度范围内是稳定的。第二种是使结合到离子交换器的所有分离的组分能够在洗脱液梯度范围内洗脱。此外，梯度范围可以尽可能小以提高分辨率。

5.洗脱速度

洗脱液的流速也影响离子交换色谱的分离效果，洗脱速率通常保持恒定。一般来说，慢洗脱速度要好于快分辨率，但洗脱速度太慢会造成分离时间长、样品扩散、光谱峰宽、分辨率降低等副作用，因此根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中在某个区域，则应减小梯度范围或降低洗脱速度以提高分辨率。如果分辨率良好，但洗脱峰太宽，则可以适当地提高洗脱速度。

6.样品的浓缩和脱盐

通过离子交换色谱法获得的样品通常具有较高的盐浓度、较大的体积和较低的样品浓度。因此，通过离子交换色谱法获得的样品应进行浓缩和脱盐。

离子交换色谱法的应用

离子交换色谱法有着广泛的应用，主要在以下几个方面。

1.水处理

离子交换色谱法是一种简单有效的去除水中杂质和离子的方法。聚苯乙烯树脂广泛应用于高纯水的制备、硬水软化和污水处理。纯水可以通过蒸馏制备，但它消耗大量能量，而且制备量小、速度慢、纯度不高。通过离子交换色谱法可以快速、大量地制备高纯水。通常，水依次通过H+型强阳离子交换器，以去除吸附在阳离子交换器上的各种阳离子和杂质；然后，通过OH型强阴离子交换剂，去除阴离子交换剂吸附的各种阴离子和杂质，得到纯水。经过弱阳离子和阴离子交换剂的进一步纯化，可以获得高纯度的纯水。离子交换器在使用一段时间后可以通过再生处理进行再利用。

2.小分子的分离和纯化

离子交换色谱法还广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子的分离纯化。例如，分析氨基酸，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合物置于pH2~3柱上。此时，氨基酸在树脂上结合，然后逐渐提高洗脱液的离子强度和pH，从而使各种氨基酸以不同的速率洗脱，并可以分离和鉴定。提供所有自动氨基酸分析仪。

3.生物大分子的分离纯化

离子交换色谱法是根据物质带电性质的不同，分离纯化蛋白质等生物大分子的重要手段。由于生物样品中蛋白质的复杂性，仅用一次离子交换色谱法通常很难达到高纯度，并且经常与其他分离方法结合使用。离子交换色谱法分离样品应充分利用根据带电性质进行分离的特点，只要选择合适的条件，离子交换色谱可以获得满意的分离结果。

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