处理16s测序数据时，相信很多同学已经看倦了常见的Alpha、Beta多样性分析，PCA分析之类，那么除了这些标准内容，我们还能做些什么呢？

此前，我们介绍了如何进行网站在线OTU互作网络分析——OTU互作网络分析用MENA，而今天我们又来推荐一个新方法——CoNet。CoNet全称是Co-occurence network inference，也可以称为共现性网络分析，可用于探究微生物之间的互作关系，例如探究土壤微生物之间的交流模式[1]，再比如探究人体微生物的共现与互斥关系[2]。目前针对这一分析方法开发出了Cytoscaep相应的分析插件CoNet，利用这个插件可以直接进行分析，操作简单上手快！

数据准备

CoNet分析应用的文件可以是BIOM文件，也可以是由它转换而来的OTU丰度矩阵文件。格式上的要求（如下图)：第一列是OTU名称ID, 之后的每一列的列名是样品名称，每一行数据表示OTU在每个样品中的丰度。而最后一列是OTU的分类世系信息，涉及门纲目科属种等。OTU数据也可以只是具体到属水平的分类。

也可以准备环境因子数据进行联合分析，如下：

插件安装

Cyroscape的安装可以参考：Cytoscape-网络图绘图技巧。而进行CoNet之前需要在Cytoscape上安装CoNet插件，同时需要安装CytocCluster，方便对生成的网络进行聚类分析，从而划分模块。而开始分析的页面也就是下图显示的页面。

导入数据与设置

点击Data menu。在弹出的窗口选项——Select  file中导入丰度矩阵，并进行相关设置（如下图）。

完成初步数据设置之后，选择该窗口的Metadata and features(optional)，开始其他设置，并导入环境因子数据，包括勾选explore links between higher-level taxa，Parent-child exclusion，以及对环境因子数据进行设置（如下图）。

数据过滤

完成上一步之后，回到主菜单，选择Preprocessing and filter menu，开始对数据进行过滤，同时进行数据的标准化。

计算方法

在Method menu进行相关性、相似性以及距离计算方法的选择。例如下图的组合方式：Pearson、Spearman、Mutual information、BC以及KLD。

通过该窗口选择Automatic threshold setting，设置网络阈值，选择edgeNumber 和Top and bottom，并填写上对应的数值100，可以按照实际填写。

ReBoot

进入Randomization menu，先进行Permutaion，设置Routine 、Resampling，重新标准化Renormalize，以及进行空分布文件的的保存等等（如下图）。设置完成之后，进入主菜单点击GO。

完成Permutation，开始进行Bootstrap，在相同窗口中进行设置，修改Resampling，取消重新标准化Renormalize，设置P-value merge方法为Brown，多重检验benjaminihochberg，同样保存随机化文件，并导入刚刚计算的空分布文件（如下图），进入主菜单点击GO。

恢复网络（可选）

基于前一步生成的文件恢复CoNet网络，在前一步的设置上基础上，取消文件保存，并导入生成的随机文件（如下图），之后点击主菜单GO。

网络图基本设置与聚类分析

参考Cytoscape-网络图绘图技巧进行网络图点线设置，可以获得如下结果。

此外，结合CytoCluster对网络进行聚类分析，对网络进行模块划分，部分结果如下：

愿大家get多多技能 ，学习快乐！

参考文献：

[1] Durrer A, Gumiere T, Taketani R G, et al. The drivers underlying biogeographical patterns of bacterial communities in soils under sugarcane cultivation[J]. Applied Soil Ecology, 2016, 110.

[2] Faust K, Sathirapongsasuti J F, Izard J, et al. Microbial Co-occurrence Relationships in the Human Microbiome[J]. Plos Computational Biology, 2012, 8(7):e1002606.

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