做微生物研究必懂的OTU table相关知识

微生物多样性分析中最基础、最重要的文件为OTU table，因此理解OTU table的含义和来路，对微生物多样性分析至关重要。本文介绍OTU table是怎么样一步一步得来的，及其注意事项。

微生物多样性分析中最基础、最重要的文件为OTU table，几乎所有的后续分析，如alpha多样性分析，beta多样性分析，差异分析等等都是基于OTU table展开的。因此理解OTU table的含义和来路，对微生物多样性分析至关重要。下面我们就来介绍一下OTU table是怎么样一步一步得来的，及其注意事项。

建库测序步骤：

16s/18S/ITS rRNA测序首先需要提取环境样品的DNA，这些DNA可以来自肠道、土壤、粪便、空气或水体等任何来源。
提取DNA后需要经过质检和纯化。
加入通用引物对16s/18S/ITS rRNA基因进行扩增，完成PCR扩增之后经过切胶回收，不同的样品再加上特定的测序接头，经过定量均匀混样之后，就可以直接上测序仪测序，得到原始测序reads；
illumina测序原理视频帮助理解；

https://v.qq.com/x/page/f0519pz5jmw.html

原始数据处理：

根据测序barcode序列区分不同的样本序列,将数据分开至不同的样品中。
原始测序数据需要去除接头序列，并将双端测序序列通过序列之间的overlap拼接成单条序列（Tags），此步可由flash[1]软件完成。
过滤低质量序列和去除嵌合体序列。

什么是嵌合体？

在PCR反应中，在延伸阶段由于不完全延伸，就会导致嵌合体序列的出现。如下图所示：在扩增序列Template1的过程中，在序列延伸阶段，只产生了部分Template1序列在延伸阶段就结束了，在下一轮的PCR反应中，这部分序列作为序列Template2的引物接着延伸，扩增就会形成Template1和Template2的嵌合体序列。通常在PCR过程中，大概有1%的几率会出现嵌合体序列，而在16S/18S/ITS 扩增子测序的分析中，由于序列相似度很高，嵌合体可达1%-20%，因此需要去除嵌合体序列。去除嵌合体可以将拼接好的Tags比对到参考数据库当中确定嵌合体，然后进行去除，这一步可以用mothur[2]软件实现。

图注:PCR嵌合体生成

用vsearch去除嵌合体：

for i in `cat $fastmap |grep -v '#'|cut -f 1`; do 
     #相同重复序列合并
    vsearch --derep_fulllength $workdir/3.data_qc/${i}.clean_tags.fq.gz \
        --sizeout --output ${i}.derep.fa
    #去嵌合体
    vsearch --uchime3_deno ${i}.derep.fa \
        --sizein --sizeout  \
        --nonchimeras ${i}.denovo.nonchimeras.rep.fa 
    #相同序列还原为多个
    vsearch --rereplicate ${i}.denovo.nonchimeras.rep.fa --output ${i}.denovo.nonchimeras.fa
done

#根据参考序列去除嵌合体：
for i in `cat $fastmap |grep -v '#'|cut -f 1`; do 
    vsearch --uchime_ref ${i}.denovo.nonchimeras.fa \
        --db $dbdir/rdp_gold.fa \
         --sizein --sizeout --fasta_width 0 \
        --nonchimeras ${i}.ref.nonchimeras.fa
done

什么是OTU

OTU(operational taxonomic units) 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。通常按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU，每一个 OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种，相似性小于95%，可以认为属于不同的属。

为什么引入OTU

高通量测序得到的16S序列有成千上万条，如果对每条序列都进行物种注释的话，工作量大、耗时长，而且16S扩增、测序等过程中出现的错误会降低结果的准确性。在16S分析中引入OTU，首先对相似性序列进行聚类，分成数量较少的分类单元，基于分类单元进行物种注释。这不仅简化工作量，提高分析效率，而且OTU在聚类过程中会去除一些测序错误的序列，提高分析的准确性。

序列聚类形成OTU

聚类生成OTU的三种方法：

1、de novo OTU 聚类，是将所有序列直接按照两两之间的相似度，划分成一个个OTU，选取该OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，然后用代表序列比对参考数据库，获得该OTU的物种注释。常用数据库有RDP、Silva及Greengene，由于GreenGene和RDP数据库一直没有更新，一般采用Silva数据库进行分析。

OTU注释数据库

优点：不依赖参考数据库，尤其是所研究的样品中含有的已知物种较少，如极端环境中。
缺点：受测序错误及嵌合体影响较大，说白了就是有些序列并非真实存在，是实验过程产生的“假序列”，用这种方法聚类时就会被误认为是一个独立的OTU，不过可以通过去嵌合体等分析手段缓解。
2、closed-reference聚类，这种方法是将序列与参考数据库直接比对，比对到同一参考序列的作为一个OTU，在OTU聚类的同时，也获得了该OTU的物种注释信息。
优点：所获得的OTU可信度高；另外，由于不同文章中检测的16S区域不同，如果要合并分析，不能用de novo OTU picking的方法聚类，因此只能用close-reference方法聚类。
缺点：只能得到已知物种的序列，丢失未知物种的信息。
3 、open-reference OTU聚类，具有上述两种聚类方法的特点，即将序列与参考序列比对，未比对上的序列再进行de novo聚类。兼具上述两种方法的优点，但无法用于不同16S区域的合并分析。
由于目前的参考数据库信息有限，所以OTU的注释结果中常见到一些uncultured*之类的没有分类信息。

三种OTU聚类方法

经过OTU聚类和对OTU进行物种分类注释就可以得到一个OTU table了，这里包含每个样本所含的OTU种类及序列数，同时还有各个OTU的物种注释信息。一般如果没有特殊分析要求的话，应采用denovo的方法聚类获取OTU以最大限度的保留样品中物种种类，此分析过程可以用qiime[3]软件完成。具体如下图所示:

OTU table

如果某个样品的测序量较大（测序技术无法保证每个样品的测序量绝对的一致），相应的测到该样品中各种微生物的序列数会比其他样品多，即每个OTU中分到的序列数相应增加。因此OTU的序列数不能直接进行样品间的横向比较，而是要将序列数转化为比例也就是相对丰度（即序列数除以该样品的测序总序列数），得到该OTU在该样品中的比例，用这一比例进行横向比较。我们就可以说该OTU的丰度在不同样品间是升高了还是降低了。到这里，我们已经知道样品中的物种及其比例，可以根据比例绘制OTU丰度柱状图如下：

样品丰度比较

至此我们得到了，OTU table表格，后续的分析就很好展开了。

参考文献：
[1] T. Magoc and S. Salzberg. FLASH: Fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics 27:21 (2011), 2957-63.
[2] Patrick D. Schloss,et al. Introducing mothur: Open-Source, Platform-Independent, Community-Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities. Appl. Environ. Microbiol. December 1, 2009 75:23 7537-7541;
[3] J Gregory Caporaso, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods, 2010; doi:10.1038/nmeth.f.303

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