vcf格式文件基础知识与编辑操作详解

vcf格式文件基础知识与编辑操作详解

1. VCF文件基础知识介绍：

VCF文件介绍:
做过DNA重测序，群体遗传进化，BSA，GWAS等项目的人都会遇到VCF文件，这个文件记录了所有样品基因组中所有位置变异（主要包括SNP和InDel）信息。后续几乎所有的分析内容都是基于此文件，比如进化树分析、群体结构分析、PCA分析、GWAS关联分析等等。

因此了解VCF文件格式及其记录结果的意义非常重要。VCF文件其实是文本文件，可以用Windows当中文本编辑器软件打开，比如editplus等。由于VCF文件往往很大（通常超过1G），在Windows系统下直接打开会消耗大量内存进而造成卡死的现象。如果想顺利打开的话，这里建议使用pilotedit（http://www.pilotedit.com/）。

官方说明：http://www.internationalgenome.org/wiki/Analysis/vcf4.0/

下面是一个典型VCF文件的部分示例（可左右拖动）：


##fileformat=VCFv4.0
##fileDate=20090805
##source=myImputationProgramV3.1
##reference=1000GenomesPilot-NCBI36
##phasing=partial
##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth">
##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency">
##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele">
##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129">
##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership">
##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10">
##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth">
##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality">
#CHROM POS     ID        REF ALT    QUAL FILTER INFO                              FORMAT      NA00001        NA00002        NA00003
20     14370   rs6054257 G      A       29   PASS   NS=3;DP=14;AF=0.5;DB;H2           GT:GQ:DP:HQ 0|0:48:1:51,51 1|0:48:8:51,51 1/1:43:5:.,.
20     17330   .         T      A       3    q10    NS=3;DP=11;AF=0.017               GT:GQ:DP:HQ 0|0:49:3:58,50 0|1:3:5:65,3   0/0:41:3
20     1110696 rs6040355 A      G,T     67   PASS   NS=2;DP=10;AF=0.333,0.667;AA=T;DB GT:GQ:DP:HQ 1|2:21:6:23,27 2|1:2:0:18,2   2/2:35:4
20     1230237 .         T      .       47   PASS   NS=3;DP=13;AA=T                   GT:GQ:DP:HQ 0|0:54:7:56,60 0|0:48:4:51,51 0/0:61:2
20     1234567 microsat1 GTCT   G,GTACT 50   PASS   NS=3;DP=9;AA=G                    GT:GQ:DP    0/1:35:4       0/2:17:2       1/1:40:3

整体说明信息（Meta-information lines）

VCF文件的开头是整体注释信息，通常以##作为起始，其后一般接以FILTER，INFO，FORMAT等字样。

例如：以##FILTER开头的行，表示注释VCF文件当中第7列中缩写词的说明，比如q10为Quality below 10；##INFO开头的行注释VCF第8列中的缩写字母说明，比如AF代表Allele Frequency也就是等位基因频率；##FILTER开头的行注释VCF第9列中的缩写字母说明；另外还有其他的一些信息，文件版本"fileformat=VCFv4.0"等等。

VCF各列意义说明

各列之间用tab空白隔开；前面9列为固定列，第10列开始为样品信息列，可以无限多个；

  • #CHROM

  • POS

  • ID

  • REF

  • ALT

  • QUAL

  • FILTER

  • INFO

  • FORMAT

  • 后面的列都为样品基因型信息列

具体说明如下

  1. CHROM  记录染色体编号

  2. POS 记录染色体位置信息

  3. ID  SNP/INDEL的dbSNP编号通常以rs开头，一般只有人类基因组才有dbSNP编号

  4. REF 参考基因组碱基类型，必须是A,C,G,T,N且都大写。

  5. ALT 变异碱基类型，必须是A,C,G,T,N，. 且都大写，多个用逗号分割。"."表示这个地方没有reads覆盖为缺失。

  6. QUAL 变异信息的检测质量值，越高越可靠。

  7. FILTER  标记过滤结果的列，通常我们把VCF文件中的变异信息进行质控，过滤掉低质量的变异位点，如果该位点通过过滤标准那么我们可以在该列标记为"PASS",说明该列质量值高。标记完之后我们就可以用其他工具，把标记为"PASS"的列给筛选出来，这样方便后续分析。如果没有应用缺失值"."代替。

  8. INFO 为附加信息列，一般以=；形式添加额外的注释信息列，常见的如DP=18 表示该位点测序深度为18X；AF=0.1表示等位基因频率为0.1；

  9. FORMAT 为后面10列信息的说明列，通常以":"隔开各个缩写词。不同的变异检测软件可能会有差异，以下用GATK的检测结果为例：

  10. 10列（包含）以后为样品基因型列，各信息以":"分隔与FORMAT列一一对应；

  • GT 表示genotype，通常用”/” or “|”分隔两个数字，“|”phase过也就是杂合的两个等位基因知道哪个等位基因来自哪条染色体；0代表参考基因组的碱基类型；1代表ALT碱基类型的第一个碱基（多个碱基用","分隔），2代表ALT第二个碱基，以此类推；比如 REF列为：A， ALT列为G,T；那么0/1基因型为AG 杂合，1/1基因型为GG纯合SNP；1/2代表GT基因型；./.表示缺失；

  • AD 两种碱基各自支持的碱基数量，用","分开两个数据，分别代表两个等位基因的深度；

  • DP 该样品该变异位点的测序深度总和，也就是AD两个数字的和；

  • PL 归一化后各基因型的可能性，通常有三个数字用','隔开，顺序对应AA,AB,BB基因型，A代表REF，B代表ALT(也就是0/0, 0/1, and 1/1)，由于是归一化之后，数值越小代表基因型越可靠；那么最小的数字对应的基因型判读为该样品的最可能的基因型；

  • GQ 针对PL的判读得到的基因型的质量值，此值越大基因型质量值越好。由于PL归一化之后通常最小的数字为0；那么基因型的质量值取PL中第二小的数字，如果第二小的数字大于99，我们只取99，因为在GATK中再大的值是没有意义的，第二小的数大于99的话一般说明基因型的判读是很可靠的，只有当第二小的数小于99的时候，才有必要怀疑基因型的可靠性。

介绍到这里，大家应该对VCF文件有了一个初步理解，如有其他问题请下方留言。

2. VCF文件处理工具介绍：

筛选特定条件下的SNP/Indel信息是比较常见的个性化分析需求，不过VCF文件通常比较大，不建议在Windows当中处理。那么我们怎么筛选处理VCF文件呢？这里介绍一个Linux中非常好用的vcf处理工具，vcftools http://vcftools.sourceforge.net/man_latest.html。这是他的帮助链接; 功能非常丰富；vcftools是一款处理vcf文件的工具，体积小、运行速度快，可以按位点信息、碱基位置等信息筛选特定条件下的变异信息，也可以比较两个vcf文件之间变异信息的差异，还可以对VCF文件拆分，格式转换，质量过滤筛选等等功能；强烈推荐使用；这里介绍一下我在工作中用过的一些命令选项。

过滤变异类型

vcf文件中可能会同时包含snp以及indel两种变异类型，vcftools可以很快的将两者进行分离。

使用方法：

过滤掉indel，只保留snp，用到的命令选项：--remove-indels。  

执行以下命令：

vcftools --remove-indels --recode --recode-INFO-all --vcf raw.vcf --stdout >raw.snp.vcf

过滤掉snp，只保留indel，用到的命令选项：--keep-only-indels。  

执行以下命令：

vcftools --keep-only-indels  --recode --recode-INFO-all --vcf raw.vcf --stdout >raw.indel.vcf

这样，就可以分别得到只包含snp和indel的vcf文件。

筛选指定位置变异位点

vcftools还可以挑选出基因组上某些区域的变异信息。

使用方法：

vcftools --vcf Variants.snp.unknown_multianno.vcf --chr A03 --from-bp 577700 --to-bp 607700 --out out_prefix --recode --recode-INFO-all

这里解释一下各个参数：

--vcf：后面跟的是vcf文件      

--chr：后面跟筛选区域所在的染色体      

--form-bp：后跟筛选区域的起始位置      

--to-bp：后跟筛选区域的终止位置      

--out：输出文件的前缀      

--recode：没有此参数则不会输出

过滤指定缺失率的变异位点

vcf 文件中很多snp在某些样品中是缺失的，也就是基因型为 "./." 。如果缺失率较高，这种snp位点在很多分析中是不能用的，需要去掉。这里用到的选项是 --max-missing。

使用方法：

vcftools  --vcf snp.vcf  --recode --recode-INFO-all --stdout  --max-missing 1 > snp.new.vcf

--max-missing 后跟的值为 0-1 ，1代表不允许缺失，0代表允许全部缺失。

计算snp缺失率

vcftools中有两个参数可以计算vcf文件中snp的缺失率。 

 分别是：  

--missing-indv：生成一个文件，报告每个样品的缺失情况，该文件的后缀为“.imiss”。  

--missing-site：生成一个文件，报告每个snp位点的缺失情况，该文件的后缀为“.lmiss”。

使用方法：

vcftools --vcf  snp.vcf.   --missing-site 

运行以上命令后会在当前目录生成一个 out.lmiss 文件，其格式如下：

CHR     POS     N_DATA  N_GENOTYPE_FILTERED     N_MISS  F_MISS
chr01   194921  988     0       368     0.37247
chr01   384714  988     0       204     0.206478
chr01   384719  988     0       202     0.204453
chr01   518438  988     0       488     0.493927
chr01   518473  988     0       452     0.45749
chr01   518579  988     0       418     0.423077
chr01   518635  988     0       428     0.433198
chr01   680786  988     0       346     0.350202
chr01   680834  988     0       412     0.417004

前两列为snp所在位置，第三列为等位基因总数，第5列为缺失的总数，最后一列为缺失率。

vcftools --vcf  snp.vcf.   --missing-indv

运行以上命令后会在当前目录生成一个 out.imiss 文件，其格式如下：

INDV    N_DATA  N_GENOTYPES_FILTERED    N_MISS  F_MISS
1       8747    0       3632    0.415228
10      8747    0       1264    0.144507
102     8747    0       2016    0.230479
105     8747    0       6322    0.722762
106     8747    0       2365    0.270378
107     8747    0       4376    0.500286
108     8747    0       5682    0.649594
109     8747    0       1877    0.214588
11      8747    0       1039    0.118784

第一列为样品名称，第二列为总的snp数，第4列为缺失的总数，最后一列为缺失率。

随机抽取指定个样品

vcftools可以随机抽取指定个样品的vcf文件，用到的选项为  --max-indv  ，指定要从vcf文件中随机抽取指定个样品。

使用方法：

随机抽取5个样品，执行以下代码：

vcftools --vcf snp.vcf --max-indv 5 --remove-indels --recode --out outfilename

最后附上vcftools使用手册：vcftools使用手册

vcftools就讲到这了，有兴趣的同学赶快试一下吧！


此外，我们在网易云课堂上有各种教学视频，有兴趣可以了解一下：

1. 文章越来越难发？是你没发现新思路，基因家族分析发2-4分文章简单快速，学习链接：基因家族分析实操课程

2. 转录组数据理解不深入？图表看不懂？点击链接学习深入解读数据结果文件，学习链接：转录组（有参）结果解读；转录组（无参）结果解读

3. 转录组数据深入挖掘技能-WGCNA，提升你的文章档次，学习链接：WGCNA-加权基因共表达网络分析

4. 转录组数据怎么挖掘？学习链接：转录组标准分析后的数据挖掘

5. 微生物16S/ITS/18S分析原理及结果解读

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  • 发表于 2019-05-24 15:13
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  • 分类：软件工具

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