作为经典的基因定位方法，BulkedSegregant Analysis（BSA，集群分离分析法）具有适用范围广，群体要求低，实验成本低的优势，能够有效对质量性状或数量性状的主效基因进行定位。

但很多初次接触的老师仍对BSA的取样、提取、测序等方面有不少疑问，在此我们总结了10个设计BSA时最常见的问题，希望对大家有所帮助。

Q1：取材时对亲本有什么要求？

A1：亲本要选用尽量纯的个体，可通过自交进行纯化，两个亲本要在目标性状上有显著差异，但其他性状尽量保持一致，以降低后期定位分析的干扰。

Q2：对子代群体有什么要求？

A2：理论上来说，只要目标性状不同的亲本杂交后代产生了性状分离都可以拿来做BSA，但是比较常用的群体有：F2、回交群体、重组自交系等。

如果是质量性状，子代的显隐性个体比值可能有1:1、3:1等情况；数量性状的话，子代性状应当符合正态分布为佳，如果严重偏离，需要考虑是否有隐性致死基因产生了作用。

Q3：没有亲本是否可以做BSA？

A3：可以，但是不建议。目前主流的定位算法有ED法和snp-index法，其中ED法可以在没有亲本的情况下进行，但这样定位效果肯定不如有双亲数据的实验。建议重新杂交构建群体，保存好亲本DNA，以备后用。

Q4：子代取多少样品才够呢？

A4：子代的取样应当符合以下原则：定位质量性状的，应该取尽可能多的隐性个体，最低不能低于20个，一般在30-50之间，然后取对应数量的显性个体；定位数量性状的，一般是选择最极端的各5%-10%性状的个体，还可以将子代的性状数据做个类似如下的直方图：

然后结合直方图的信息，共同来选择样品，如上图所示，最左侧的两列和最右侧的两列适合取样。

Q5：子代群体规模不够，应该优先取极端还是优先取数量？

A5：很多物种的子代群体很难做到200个以上，就会出现极端个体不足20的情况，这时我们建议宁可少取些样品，也不要把性状居中的样品选择进去，只会对后期分析产生干扰。当然每一个池只有十来个样品的实验，是否能够得到满意的结果，是存在一定风险的。

Q6：提取子代DNA时应当先混后提，还是先提后混？

A6：理想状态是将每个子代样品都单独提取DNA，然后根据DNA的浓度，等量均匀混合成一份DNA，这样各个子代的DNA信息量是等量的。但由于目前测序项目成交价较低，一般公司的做法是让客户从每个样品上取等量的组织混合，然后提取作为混池DNA样品。

等组织样混合提取效果不如单样品提取后混合，但是其影响完全是可以接受的。先混合再提取虽然会导致来自每个样品的DNA并不等量，但取样足够理想的话，这些样品在目标位点的基因型应该是一致的，主要影响的是背景噪音的组成，这样并不影响我们后期数据分析时找到目标位点。

Q7：做重测序对DNA的质量要求是怎么样的？

A7：虽然每个公司的具体要求略有不同，但重测序对DNA的质量要求并不太苛刻。需要您自己做的是跑一下琼脂糖胶，观察主带是否清晰，是否无蛋白污染，另外用分光光度计检测下浓度和总量（建议浓度不低于20ng/ml，总量不低于2微克）。

Q8：重测序时对亲本和子代的测序深度要求是多少？

A8：为保证SNP、InDel标记的准确性，测序应当保证一定的深度，亲本建议不低于20×，混池应当结合取样数量来定，平均每个样品不低于1×，比如子代是30+30，那么每个子代混池的测序深度就不能低于30×，经费允许的话，可以再适当加深。

Q9：定位效果不理想可能是什么原因导致的？

A9：导致定位不理想的因素很多，主要有以下几点：

① 亲本间遗传背景差异大，除了目标性状外，还有很多其他差异，这样对分析产生的干扰很大，难以定位；

② 性状统计复杂，目标性状可能是由多个简单性状构成，可以拆分性状，重新定位，另外数量性状本身也定位难度较高，有一定不可控性；

③ 测序数据有污染，可以通过抽取部分测序数据在nr库里做blast比对，检查比对结果；

④ 分析方法不适用，可以分别用ED法和snp-index法进行定位，比较定位结果。

Q10：定位区间有点大，怎么进一步往下做？

A10：为了进一步缩小定位区间，可以在BSA定位区间内找些SSR、SNP或者InDel标记，进行局部作图，可以有效的缩小定位区间。

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