测序时每个循环在荧光基团淬灭，去3’端保护基团时，去除不彻底，导致在延伸过程滞留，或者是加入了无3’端保护的碱基，导致延伸超前，滞留和超前造成延伸步调不同，随着循环增加，超前或滞后的累积增多，测序错误率也就随之增高；另一方面，随着测序时间延长，酶活性及试剂的有效性都会降低，因为测序是先测read1，后测read2，所以read2的错误率要稍高于read1。另外，若待测片段中存在反向互补序列，容易发生折叠，导致碱基在合成时错配。对于特异性序列GGC，若后面的碱基是G，GGC这种结构引起聚合酶偏好性的改变，会使错误率增高。