刚接触高通量测序的时候就知道有链特异性建库这么个概念，当时也了解可以利用加U法，但是没有思考其中的细节。最近把这个概念掰开了揉碎了好好理解，终于填上了这个坑。
正式讲之前，有几个概念是要明确的。
DNA 的正链和负链，就是那两条反向互补的链。参考基因组给出的那个链就是所谓的正链（forword），另一条链是反链（reverse）。但是这正反一定不能和正义链（sense strand）反义链（antisense strand）混淆。
正义链（sense strand）：两条互补的DNA链其中一条携带编码蛋白质信息的链称为正义链，又称编码链，因为它的序列与mRNA相同。
反义链（antisense strand）：另一条与之互补的称为反义链。而反义链虽然和RNA反向互补，但它可是真正给RNA当模板的链，因此反义链也是模板链。
要注意的是：在一条包含有若干基因的双链DNA分子中，各个基因的正义链并不都是在同一条链上。
也就是说，有的基因的正义链是正链（forword strand），有的基因的正义链是反链（reverse strand）。所以，DNA双链中的一条链对某些基因来说是正义链，对另一些基因来说则是反义链
总结两点
正义链（sense strand）= 编码链（coding strand）= 非模板链
forword strand 上可以同时有sense strand 和 antisense strand。因为这完全是两个不同的概念
下面通过这张建库示意图来看看普通RNA-Seq建库和链特异性建库的差异在什么地方
首先说说普通的RNA-Seq建库方式：它是在RNA逆转录成双链cDNA的两端，对称地加上了两个Y型的接头，然后变成文库。它有一个缺点，就是它是以双链DNA进行测序。所以测完序后，我们无法知道测出来的reads是来自正链还是负链。
而链特异性建库（以图中间的dUTP方法为例）则是首先利用随机引物合成RNA的一条cDNA链，在合成第二条链的时候用dUTP代替dTTP，加adaptor后用UDGase处理，将有U的第二条cDNA降解掉。降解发生之后，双链的文库就只剩下了一条链（负链）。而这条链的两头是接的不同序列的接头。通过PCR扩增，最终只保留了第一条cDNA（负链）上级测序。这样最后的insert DNA fragment都是来自于第一条cDNA（负链），也就是dUTP叫fr-firststrand的原因。在测序的过程中先测得正链reads，再测得负链reads（能区分正负链reads，这就是和普通建库最根本的不同）。在这些reads比对到参考基因组时，那些比对到基因方向（正义链方向）的正链reads就是正义链reads，但是那些比对到基因方向反方向（反义链方向）的正链reads就是反义链reads。那么同样，比对到基因方向的负链reads就是正义链reads，而比对到基因方向反方向（反义链方向）的负链reads就是反义链reads。从而最终将所有正义链reads和反义链reads区分开来。因此在确定基因表达水平时，可以避免基因反义链上的reads匹配的干扰，从而更加准确的检测基因转录表达水平。而且LncRNA的测序也离不开链特异性建库技术。原因有三：
1）lncRNA的来源是具有链特异性的；
2）lncRNA来源就是编码蛋白（mRNA）基因的反义链，是传说中的天然反义lncRNA（NAT-antisense lncRNA）；如果是普通非链特异性建库，那么序列是来自mRNA，还是NAT-antisence LncRNA就难以区分了；
3）链特异性建库可更准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，准确区分获得的转录本来自基因组哪条链。
链特异性文库参数设置：
高级生物信息分析课程：重测序数据自主分析、二代测序转录组数据自主分析、微生物扩增子分析课程实操
